Procedimiento de estabilización de un crioprecipitado de proteinas plasmáticas destinado a someterse a un tratamiento térmico de inactivación viral.

Procedimiento de obtención de proteínas crioprecipitables exentas de hidratos de carbono y de tampón tris,

que comprende una etapa de inactivación viral mediante tratamiento térmico de un liofilizado de dichas proteínas, caracterizado porque comprende, antes de poner las proteínas en forma de liofilizado, una etapa inicial de adición, a dichas proteínas, de una formulación estabilizadora y solubilizadora exenta de hidratos de carbono y de tampón tris, que comprende una mezcla de arginina, con al menos un aminoácido hidrófobo y citrato trisódico.

Procedimiento de estabilización de un crioprecipitado de proteinas plasmáticas destinado a someterse a un tratamiento térmico de inactivación viral La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas crioprecipitables derivadas del plasma sanguíneo, en general mediante crioprecipitación o precipitación con alcohol en frío, que comprende una etapa de liofilización y una etapa posterior de inactivación viral mediante tratamiento térmico del liofilizado, que comprende una etapa de adición de una formulación estabilizadora y solubilizadora que permite una liofilización de las composiciones líquidas de dichas proteínas y una fácil disolución de las formas liofilizadas posterior al tratamiento térmico de inactivación viral. En el marco de la invención, el término "proteína" abarca la proteína como tal y también los concentrados y las fracciones que contienen esta proteína, sola o mezclada con otras proteínas, fundamentalmente para uso terapéutico. Estos concentrados y fracciones se obtienen por métodos de fraccionamiento del plasma humano o animal conocidos en la técnica anterior. Asimismo, la expresión "composición líquida de proteínas crioprecipitables" designa una composición líquida que comprende al menos una proteína caracterizada por su insolubilidad en frío durante la descongelación de un plasma humano o animal congelado, o bien, por su insolubilidad en una precipitación mediante la adición al plasma de un solvente orgánico como el etanol, en frío.

La utilización de productos terapéuticos derivados del plasma humano, como los factores de la coagulación, con fines terapéuticos, fundamentalmente en el caso de trastornos hemorrágicos hereditarios como la hemofilia, puede verse muy comprometida por el gran riesgo que presenta para el paciente la presencia de virus en los productos sanguíneos. A pesar de que los donantes individuales se seleccionan de manera rigurosa, sigue habiendo un riesgo de transmisión de diversos virus, fundamentalmente los de la hepatitis y el SIDA, y de virus desconocidos hasta este momento que pueden revelarse transmisibles a través de los productos sanguíneos.

Por consiguiente, debe evitarse la transmisión viral mediante tratamientos adecuados de las diferentes fracciones purificadas derivadas del plasma de los donantes y destinadas a un uso terapéutico. A este respecto, se conocen diversos métodos de inactivación o de eliminación viral aplicados a diversas fracciones proteínicas derivadas del plasma sanguíneo. Por ejemplo, podemos mencionar los tratamientos con solvente-detergente, ultrafiltración y nanofiltración, la pasteurización o el calentamiento prolongado. El calentamiento prolongado suele aplicarse únicamente a fracciones de proteínas del plasma previamente liofilizadas que requieren temperaturas de calentamiento de al menos 70 °C en lapsos de tiempos comprendidos entre 50 y 100 horas para lograr una inactivación viral óptima. No obstante, en tales condiciones extremas de tratamiento térmico, las proteínas plasmáticas, frágiles y termolábiles sufren degradaciones, provocando disminuciones importantes de sus funciones biológicas.

Para solucionar este inconveniente, se añaden previamente excipientes protectores y estabilizadores de proteínas plasmáticas a las composiciones proteínicas líquidas antes de la liofilización para responder a un doble objetivo conjunto. El primer objetivo responde a la necesidad de una estabilización, por un lado, de las proteínas consideradas durante la liofilización y, por otro lado, de las proteínas liofilizadas durante el almacenamiento. El segundo objetivo corresponde a la necesidad de proteger las proteínas liofilizadas durante el tratamiento térmico de inactivación viral.

La patente EP 0 094 611 describe un método de calentamiento de fracciones proteínicas liofilizadas del plasma, el factor VIII o el fibrinógeno, que consiste en someter el producto seco a una temperatura de calentamiento de 60 °C, durante 72 a 96 horas. Esta patente no menciona ninguna composición particular de excipientes estabilizadores durante el tratamiento térmico.

La patente canadiense 1 260 389 menciona la incorporación de excipientes, como los aniones no polares de masa molecular superior a 80, los azúcares, los azúcares reductores y, fundamentalmente, los aminoácidos, en composiciones líquidas de proteínas del plasma antes de la liofilización para conferirles una estabilización en calentamiento en seco durante aproximadamente 72 horas, a 68 ºC. Sin embargo, la asociación de azúcares reductores con aminoácidos deriva en compuestos de Maillard cuyas propiedades no favorecen la buena inocuidad de las proteínas tratadas (actividad, inmunogenicidad, alergias, etc.) Este tratamiento necesita realizarse al vacío o en atmósfera inerte.

La mayoría de los excipientes estabilizadores pueden revelarse protectores de fracciones de proteínas plasmáticas durante el tratamiento térmico en seco de las mismas, a temperaturas del orden de 60-68 °C durante 30 a 96 horas (P. Thomas, British Journal of Haematology, 70, 1998, 393-395 y J.A. Levy et al., The Lancet, June 22, 1985, 14561457) . No obstante, a pesar de que la carga viral disminuye después de un tratamiento en esas condiciones, se demostró que podían trasmitirse infecciones tales como HIV, HBV, HBC y parvovirus B19 (P. Thomas mencionado anteriomente) . Para eliminarlos de modo eficaz, se propuso calentar las fracciones de proteínas plasmáticas liofilizadas a temperaturas más elevadas. De este modo, S.J. Skidmore et al. (Journal of Medical Virology, 30, 1990, 50-52) demostraron que un tratamiento térmico de concentrados de factor VIII liofilizados, a una temperatura de 80 °C durante 72 horas, evita la transmisión del virus VHC no-A y no-B. La patente US 5 831 027 describe un procedimiento de tratamiento térmico de una proteína liofilizada derivada del crioprecipitado de plasma sanguíneo, el fibrinógeno, a una temperatura de 80 °C durante 72 horas, que permite la obtención del fibrinógeno exento de eventuales virus tales como los de VHB, HBC o el parvovirus B19. Los excipientes estabilizadores agregados para proteger la composición de fibrinógeno tanto durante la liofilización como durante el tratamiento térmico de inactivación viral, comprenden sacarosa y/o un aminoácido (arginina) , tampón tris y citrato de sodio L. Wilkelman et al. (Virus Inactivation in Plasma Products., Curr.Stud Hematol Blood Transfus., Basel, Karger, 1989, N°56, 55-69) también demuestran la necesidad de agregar excipientes al factor VIII antes de la liofilización y al tratamiento térmico de inactivación viral, a 80 °C durante, 72 horas. Los excipientes descritos son: NaCl, citrato de sodio, Tris, CaCl2 y sacarosa.

Por otra parte, dado que las diferentes proteínas derivadas del fraccionamiento del plasma, que se sometieron a una liofilización y a un tratamiento térmico de inactivación viral, requieren una reconstitución en un medio adecuado antes de su utilización clínica, la misma debe poder aplicarse fácilmente en un lapso de tiempo relativamente corto, según la exigencias recomendadas por la Farmacopea Europea. A este respecto, estudios sobre la estabilidad térmica del factor VIII en un crioprecipitado liofilizado (J. Margolis et al., The lancet, December 8, 1984, 1345) que contiene, antes de la liofilización, una mezcla de aminoácidos naturales apropiada para una nutrición parenteral, el Synthamin 17% (Travenol Laboratories Ltd.) , demostraron que un tratamiento a 80 °C durante 16 horas, no sólo provocaba una degradación del factor VIII, ya que su actividad era nula, sino también la imposibilidad de volver a disolver el crioprecipitado después de las operaciones consideradas. La patente US 5 399 670 describe un procedimiento para facilitar la solubilización o la reconstitución de las composiciones del complejo de factor VIII liofilizado con agua purificada para inyección, que comprende una etapa de adición de arginina a una solución de factor VIII, antes de su liofilización. Esta patente no menciona ningún tratamiento de inactivación viral. Según esta patente, también puede preverse la adición de histidina y de albúmina. Los excipientes estabilizadores mencionados en la patente US 5 831 027, anteriormente mencionada, también están destinados a favorecer la disolución del fibrinógeno liofilizado en agua pura, antes de su uso terapéutico.

Sin embargo, la elección de una formulación estabilizadora está marcada por la especificidad de las proteínas plasmáticas. De este modo, en referencia al artículo de N. Heimburger et al. (Virus Inactivation in Plasma Products., Curr Stud Hematol Blood Transfus., Basel,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de proteínas crioprecipitables exentas de hidratos de carbono y de tampón tris, que comprende una etapa de inactivación viral mediante tratamiento térmico de un liofilizado de dichas proteínas, caracterizado porque comprende, antes de poner las proteínas en forma de liofilizado, una etapa inicial de adición, a dichas proteínas, de una formulación estabilizadora y solubilizadora exenta de hidratos de carbono y de tampón tris, que comprende una mezcla de arginina, con al menos un aminoácido hidrófobo y citrato trisódico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación está constituida por dicha mezcla de arginina, con al menos un aminoácido hidrófobo y citrato trisódico.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la concentración de arginina está comprendida entre 25 y 50 g/l.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de arginina está comprendida entre 35 y 45 g/l.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la concentración de citrato trisódico está comprendida entre 0, 5 y aproximadamente 12 g/l.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el aminoácido hidrófobo es leucina, isoleucina o una mezcla de las dos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la concentración de leucina, isoleucina o su mezcla está comprendida entre 5 y 15 g/l.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la concentración de leucina o isoleucina o su mezcla está comprendida entre 9 y 11 g/l.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque, además, se agregó leucina y/o lisina a la formulación.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la concentración de la glicina y la lisina está comprendida entre 1 y 5 g/l.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración de la glicina y la lisina está comprendida entre 1, 5 y 2, 5 g/l.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la liofilización se realiza a temperaturas comprendidas entre -40 y -30 °C, durante 48 horas.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el tratamiento térmico de inactivación viral se realiza a temperaturas comprendidas entre 80 y 90 ºC, durante 72 horas.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque además comprende, antes de la etapa de adición de la formulación estabilizadora y solubilizadora a una composición líquida de proteínas crioprecipitables, al menos una etapa suplementaria de inactivación y/o de eliminación de los virus de dicha composición líquida mediante disolvente-detergente y/o nanofiltración en filtros de 35 nm.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque es aplicable a todas las proteínas crioprecipitables.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque es aplicable a al menos una proteína elegida entre el factor VIII, el factor von Willebrand, el factor XIII, el fibrinógeno y la fibronectina.

17. Concentrado de al menos una proteína crioprecipitable exenta de hidratos de carbono y de tampón tris, que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Concentrado según la reivindicación 17, destinado a un uso terapéutico.

19. Concentrado según la reivindicación 17 ó 18, que consiste en un liofilizado de fibrinógeno disuelto obtenido mediante el procedimiento de la reivindicación 13, para presentar una drenabilidad de aproximadamente 2 ml/cm2 en un filtro con una porosidad de 0, 20 ± 0, 02 μm.

20. Formulación estabilizadora y solubilizadora, exenta de hidratos de carbono y de tampón tris, para las proteínas crioprecipitables destinadas a someterse a una liofilización y a un tratamiento térmico de inactivación viral,

caracterizado porque comprende una mezcla de arginina, presente en una concentración comprendida entre 35 y 45 g/l, al menos un aminoácido hidrófobo y citrato trisódico, presente en una concentración comprendida entre 0, 5 y 12 g/l.

21. Formulación estabilizadora y solubilizadora según la reivindicación 20, caracterizado porque la formulación está constituida por dicha mezcla de arginina, con al menos un aminoácido hidrófobo y citrato trisódico.