Un procedimiento para la preparación de una enzima interfacial inmovilizada sobre un soporte insoluble,

caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar un sistema bi-fásico que comprende una solución tampón acuosa y por lo menos un primer disolvente orgánico; (b) mezclar dicha enzima interfacial con el sistema bi-fásico proporcionado en la etapa (a); (c) añadir dicho soporte a la mezcla de la etapa (b) y mezclar; y (d) aislar de la mezcla obtenida en la etapa (c) la enzima interfacial inmovilizada sobre dicho soporte; en el que, antes de añadir dicho soporte a la solución bifásica de enzima obtenida en la etapa (b), dicho soporte se trata con un tensioactivo disuelto en un segundo disolvente orgánico, obteniéndose de esta manera un soporte cubierto homogéneamente con un tensioactivo

Enzimas interfaciales inmovilizadas de actividad mejorada y estabilizada Campo de la Invención La invención se refiere a enzimas interfaciales inmovilizadas, particularmente lipasas y fosfolipasas, así como a otras hidrolasas, que tienen actividad y estabilidad mejoradas. La invención también se refiere a procedimientos para la preparación de tales enzimas y a sus diversos usos industriales y de investigación.

Antecedentes de la Invención

Las enzimas interfaciales son una clase de enzimas que comprenden dos dominios en su estructura proteica; el primero es el dominio hidrófilo mientras que el segundo es el dominio hidrófobo. Esta característica única hace que esta clase de enzimas prefiera el área interfacial una vez presente en un sistema de dos fases. En estas condiciones, se forma la conformación activa cuando el dominio hidrófilo de las moléculas de enzima se enfrenta a la capa acuosa mientras que el dominio hidrófobo se enfrenta a la capa hidrófoba.

Las lipasas y fosfolipasas son las enzimas interfaciales más conocidas que expresan su actividad catalítica una vez que están presentes en un sistema interfacial. Las lipasas (triacilglicerol hidrolasa E.C. 3.1.1.3) se definen como enzimas hidrolíticas que actúan sobre el enlace éster del triacilglicerol en sistemas acuosos para producir ácidos grasos libres, glicéridos parciales y glicerol. Las fosfolipasas también pertenecen a la clase de enzimas hidrolíticas, sin embargo, escinden preferente y específicamente el enlace éster de fosfolípidos presentes en sistemas acuosos, para producir ácidos grasos libres, lisofosfolípidos, glicerofosfolípidos, ácido fosfatídico y alcohol libre, dependiendo del tipo de fosfolipasa.

Las lipasas y fosfolipasas están ampliamente distribuidas entre los animales, plantas y microorganismos. El interés en la aplicación industrial de las lipasas y las fosfolipasas ha crecido rápidamente durante las últimas dos décadas. Se ha descubierto que en condiciones de actividad con bajo contenido de agua esta clase de enzimas cataliza su reacción de hidrólisis inversa. La actividad catalítica inversa de las lipasas y fosfolipasas se ha explotado ampliamente para las síntesis de compuestos valiosos que contienen enlaces éster y amida u otras sustancias químicas relacionadas que contienen grupos funcionales tales grupos hidroxilo, carboxílicos y amino. En particular, las lipasas y fosfolipasas se han utilizado para la reformación de grasas, aceites, ceras, fosfolípidos y esfingolípidos para obtener nuevas propiedades funcionales deseadas, y para separar compuestos ópticamente activos de sus mezclas racémicas. De interés particular, en la presente memoria se desvelará el uso de enzimas interfaciales para la síntesis de ésteres cerosos únicos y ésteres alquílicos de cadena corta (biodiesel) .

Actualmente, hay más de 40 lipasas y fosfolipasas diferentes comercialmente disponibles, sin embargo, solamente algunas de ellas se preparan en cantidades comerciales. Algunas de las enzimas interfaciales más prometedoras industrialmente proceden de Candida antarctica, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Rhizopus or y zae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosa, Chromobacterium viscosum, semillas de papaya y pancreatina.

La inmovilización de enzimas se ha descrito por un amplio número de técnicas que se dirigen básicamente a reducir la contribución de coste de las enzimas en el proceso global, facilitar la recuperación de enzimas a partir de los productos y permitir la operación continua del proceso. Las técnicas de inmovilización, en general, se dividen de acuerdo con lo siguiente:

1. Adsorción física de enzimas en soportes sólidos, tales como sílice y polímeros insolubles.

2. Adsorción sobre resinas de intercambio iónico.

3. Enlace covalente de enzimas en un material de soporte sólido, tal como soportes inorgánicos epoxidados o poliméricos.

4. Atrapamiento de enzimas en un polímero en crecimiento.

5. Confinamiento de enzimas en un reactor de membrana o en geles semipermeables.

6. Cristales de enzimas reticulados (CLECS) o agregados de enzimas reticulados (CLEAS) .

Todos los procedimientos de inmovilización de enzimas mencionados anteriormente comprenden las siguientes etapas:

1. Disolver la enzima en un sistema tampón apropiado con respecto al pH, temperatura, tipo de sales tampón e intensidad iónica.

2. Añadir el soporte sólido a la solución de enzima y mezclar durante algún tiempo hasta que las moléculas de enzima se inmovilicen sobre el soporte sólido.

3. Separar por filtración el soporte sólido que contiene la enzima inmovilizada.

4. Lavar el soporte con un tampón apropiado para retirar las moléculas de enzima unidas sueltamente y luego secar el soporte sólido.

Se han inmovilizado enzimas interfaciales, principalmente lipasas, siguiendo las técnicas mencionadas anteriormente. Estas preparaciones de enzima inmovilizadas ofrecidas poseen baja actividad sintética y/o un tiempo de semivida operativa corto. En un intento de incrementar la actividad sintética de las lipasas inmovilizadas y otras enzimas interfaciales diferentes, se han aplicado procedimientos de activación. Estos procedimientos incluyen:

1. Unión de los grupos funcionales de superficie de las enzimas con restos hidrófobos tales como ácidos grasos o polietilenglicol.

2. Recubrimiento de la superficie de las enzimas con tensioactivos, tales como ésteres de ácidos grasos de poliol.

3. Contacto de las enzimas con soportes hidrófobos, típicamente polipropileno, que se han pretratado con disolventes hidrófilos, tales como etanol o isopropanol.

4. Adición de activadores de enzimas, tales como una solución de sal, glicerol, etc., a baja concentración, típicamente por debajo del 1%, en el sistema de reacción.

El documento WO 97/01632 desvela un procedimiento para la inmovilización de una enzima mediante la selección de una enzima anfífila para la inmovilización, la preparación de una emulsión que comprende una fase hidrófoba continua y una fase acuosa dispersa en la que se disuelven la enzima y un material adecuado para actuar como vehículo para la enzima cuando se realice la siguiente etapa, y la retirada del agua de la fase acuosa hasta que esta fase se convierta en partículas sólidas recubiertas de enzima. Una fase acuosa preferida se prepara con un líquido de fermentación de lipasa bruto del cual se ha eliminado la biomasa y que aún contiene residuos de fermentación adecuados para actuar como vehículo.

El documento WO 94/28118 desvela un procedimiento para la inmovilización de enzimas tales como lipasas en un material de soporte hidrófobo. En este procedimiento se aplica un tensioactivo no iónico. El procedimiento da como resultado nuevas lipasas inmovilizadas en un soporte hidrófobo.

Noureddini y col. (Bioresource Technology, Elsevier, 96, 7, 2005, 769-777) desvela una transesterificación enzimática de aceite de soja con metanol y etanol. Como enzima lipasa se usó lipasa de Pseudomonas cepacia, que se investigó adicionalmente en forma inmovilizada dentro de un soporte sol-gel hidrófobo químicamente inerte.

Talukder y col. (Biochemical Engineering Journal, 33, 1, 2007, 60) desvela una preparación sencilla y eficaz de lipasas para uso en disolventes orgánicos. Se tratan lipasas en solución acuosa con isopropanol, seguido inmediatamente de inmovilización en una resina macroporosa disponible en el mercado. La modificación dual de las lipasas por tratamiento con isopropanol e inmovilización mejora la actividad y estabilidad de las lipasas más significativamente que cualquiera de los dos tratamientos por separado.

El documento US 6.528.293 desvela un procedimiento para activar una lipasa mediante la adición de una solución de lipasa en un tampón acuoso a un pH próximo a la neutralidad a una fase orgánica, por ejemplo, tetradecano. En estas condiciones, la lipasa se activa como una función de la superficie límite agua-orgánica entre las fases orgánica y acuosa.

El documento D6 (WO 00/56869) desvela una preparación de lipasa que comprende una matriz insoluble y un complejo de lipasa recubierto con tensioactivo inmovilizado en dicha matriz insoluble. Se describe el uso del complejo de lipasa inmovilizado como un biocatalizador para catalizar la inter-y/o transesterificación de aceites y grasas en medios orgánicos hidrófobos.

Mateo y col. (Enzyme and Microbial Technology, 40, 6, 2007, 1451) es una revisión de estrategias... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de una enzima interfacial inmovilizada sobre un soporte insoluble, caracterizado porque comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sistema bi-fásico que comprende una solución tampón acuosa y por lo menos un primer disolvente orgánico;

(b) mezclar dicha enzima interfacial con el sistema bi-fásico proporcionado en la etapa (a) ;

(c) añadir dicho soporte a la mezcla de la etapa (b) y mezclar; y

(d) aislar de la mezcla obtenida en la etapa (c) la enzima interfacial inmovilizada sobre dicho soporte;

en el que, antes de añadir dicho soporte a la solución bifásica de enzima obtenida en la etapa (b) , dicho soporte se trata con un tensioactivo disuelto en un segundo disolvente orgánico, obteniéndose de esta manera un soporte cubierto homogéneamente con un tensioactivo.

2. Un procedimiento para la preparación de una enzima interfacial inmovilizada sobre un soporte insoluble de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sistema bi-fásico que comprende una solución tampón acuosa y por lo menos un primer disolvente orgánico;

(b) mezclar dicha enzima interfacial con el sistema bi-fásico proporcionado en la etapa (a) ;

(c) añadir dicho soporte a la mezcla de la etapa (b) y mezclar; y

(d) aislar de la mezcla obtenida de la etapa (c) la enzima interfacial inmovilizada sobre dicho soporte;

en el que, antes de añadir dicho soporte a la solución bifásica de enzima obtenida en la etapa (b) , dicho soporte se trata con un tensioactivo disuelto en un segundo disolvente orgánico, obteniéndose de esta manera un soporte cubierto homogéneamente con un tensioactivo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho soporte opcionalmente se lava para retirar sales y materiales orgánicos, y después se trata con dicho tensioactivo.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho soporte insoluble es capaz de unirse a dicha enzima mediante adsorción o mediante unión covalente a grupos funcionales.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho soporte es un soporte poroso que puede ser orgánico o inorgánico, de preferencia seleccionado del grupo que consiste en soportes inorgánicos porosos tales como soportes basados en sílice o alúmina, soportes orgánicos tales como un soporte basado en polímero, pudiendo contener dicho soporte opcionalmente grupos funcionales activos tales como grupos epoxi o aldehído, o grupos iónicos.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho primer disolvente orgánico se selecciona de alcanos (tales como octano) , alcoholes (tales como n-octanol) , aldehídos (tales como decanaldehído) y cetonas (tales como 2-octanona) y cualquier mezcla de los mismos.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho tensioactivo se selecciona de ésteres de ácidos grasos de azúcar, ésteres o éteres de ácidos grasos de azúcar de polioxietileno, alquilglucósidos de cadena media y larga, fosfolípidos, derivados de polietilenglicol y sales de amonio cuaternarias.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho segundo disolvente orgánico se selecciona de alcanos, de preferencia n-hexano, éteres, de preferencia tales como éter dietílico, cetonas, de preferencia acetona, y alcoholes, de preferencia iso-propanol, y cualquier mezcla de los mismos.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enzima es una lipasa o una fosfolipasa.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en Candida antarctica, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niupsiloneus, Mucor javanicus, Rhizopus or y zae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosa, Chromobacterium upsiloniscosum, semillas de papaya y pancreatina.

11. Una enzima interfacial inmovilizada sobre un soporte sólido que puede obtenerse por el procedimiento de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dicho soporte está cubierto homogéneamente por una monocapa de un tensioactivo, y en el que dicha enzima está bloqueada en su conformación catalíticamente activa.

12. La enzima de la reivindicación 11, en la que dicho soporte es capaz de unirse a dicha enzima por adsorción o

por unión covalente a grupos funcionales.

13. La enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, en la que dicho soporte es orgánico o inorgánico, de preferencia seleccionado del grupo que consiste en soportes inorgánicos tales como soportes basados en sílice y en alúmina, soportes orgánicos tales como un soporte basado en polímero, pudiendo contener dicho soporte grupos funcionales activos tales como grupos epoxi o aldehído y grupos iónicos o siendo dicho soporte una resina de intercambio iónico.

14. La enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicho tensioactivo se selecciona de ésteres de ácidos grasos de azúcar, ésteres o éteres de ácidos grasos de azúcar de polioxietileno, alquil glucósidos de cadena media y larga, fosfolípidos, derivados de polietilenglicol y sales de amonio cuaternarias.

15. La enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que es una lipasa o una fosfolipasa.

16. La enzima de la reivindicación 15, en la que dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en Candida antarctica, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niupsiloneus, Mucor jaupsilonanicus, Rhizopus or y zae, Aspergillus niger, Penicillium, Alcaligenes sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosa, Chromobacterium viscosum, semillas de papaya y pancreatina.

17. Un procedimiento enzimático para la preparación de ésteres cerosos estructurados, que comprende la etapa de hacer reaccionar una fuente de triglicéridos con un alcohol en presencia de una lipasa inmovilizada como se define en la reivindicación 15 o 16, o preparada por el procedimiento de la reivindicación 10, en el que dichos ésteres cerosos contienen un componente superficialmente activo inherente al material de partida en bruto, por lo que dichos ésteres cerosos poseen mejor dispersabilidad en agua.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho alcohol es un alcanol C2-22, de preferencia alcohol cetílico.

19. Un procedimiento para la preparación de ésteres alquílicos de cadena corta de ácidos grasos, de preferencia ésteres metílicos de ácidos grasos (biodiesel) , que comprende la etapa de: añadir gradualmente metanol a un aceite vegetal, animal, de alga o de pescado, o una mezcla de por lo menos dos de estos aceites que contenga una lipasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 o preparada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y dejar que proceda la reacción en condiciones adecuadas hasta que dichos triglicéridos de aceite se conviertan en ésteres metílicos de ácidos grasos.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho aceite vegetal es aceite de soja, canola, colza, oliva, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite residual de cocina o cualquier triglicérido de aceite derivado de fuentes vegetales no comestibles.