Ensayo de coagulación heterogéneo.

Método para determinar la actividad de un factor de coagulación proteolítica en una muestra;

el método comprende los siguientes pasos:

a. proporcionar e incubar una mezcla de reacción que contiene

i. la muestra,

ii. un agente para la activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico en la muestra,

iii. un sustrato disociable que tiene al menos un sitio de corte para el factor de coagulación activado,

iv. una fase sólida a la que el sustrato disociable está enlazado o se enlaza durante la incubación;

b. Separar la fase sólida; y

c. Determinar la cantidad de sustrato no disociado, enlazado a la fase sólida mediante incubación de la fase sólida con un reactivo que contiene sustancias que interactúan de modo específico con el sustrato no disociado y generan una señal medible.

Ensayo de coagulación heterogéneo.

La presente invención se encuentra en el campo de la diagnosis de coagulación y hace rerencia a métodos para determinar la actividad de factores proteolíticos de coagulación de sangre.

En la diagnosis de la coagulación se diferencian los llamados ensayos globales para investigar la funcionalidad de la cascada de coagulación de sangre y los llamados ensayos individuales para determinar la actividad de factores individuales de coagulación de sangre. Tanto para los ensayos globales como también para los ensayos individuales se conocen diferentes formatos de ensayo. Con respecto al formato de ensayo se diferencian esencialmente ensayos de coagulación y ensayos cromogénicos.

En el ensayo de coagulación, la muestra del paciente a investigarse que usualmente se componen de plasma se mezcla con un activador de coagulación el cual da inicio al proceso de coagulación. El proceso de la coagulación conduce a la formación de un coágulo de fibrina que puede medirse con ayuda de métodos fotométricos. La velocidad de formación de fibrina es una medida de la funcionalidad de la cascada de coagulación de sangre. Para determinar la actividad de un factor de coagulación individual en un ensayo de coagulación, la muestra de paciente a investigarse se mezcla con un plasma deficiente que proporciona todos los componentes de la cascada de coagulación de sangre, excepto el factor de coagulación de sangre a ensayarse.

En un ensayo cromogénico, la muestra de paciente a investigarse que se compone usualmente de plasma, se mezcla con un activador de coagulación y con un sustrato para un factor de coagulación. Puesto que la mayoría de factores de coagulación son serin-endopeptidasas, es decir hidrolasas que pueden disociar enlaces peptídicos, predominantemente se usan sustratos de péptido que se disocian de modo tan específico como sea posible por el factor de coagulación de sangre a determinarse y que tienen un grupo de señal detectable. De manera más preferida se usan grupos de señal cromogénicos o fluorogénicos disociables que se determinan fotométricamente. En los documentos de las patentes EP 34122 A1 y US 4, 508, 644 se describe un gran número de sustratos de péptido cromogénicos y su uso en ensayos diagnósticos de coagulación, por ejemplo para determinar los factores de coagulación factor IIa (trombina) y Xa. En el documento EP 78764 A1 se describe un proceso cromogénico para determinar el factor de coagulación XIIa.

En muestras de pacientes también pueden determinarse anticoagulantes que inhiben la actividad de factores de coagulación de sangre, principalmente con ayuda de los ensayos cromogénicos. Para este propósito, la muestra de paciente a examinarse se mezcla con un factor de coagulación activado y con un sustrato para este factor de coagulación. Cuanto más anticoagulante esté contenido en la muestra, más fuerte se inhibe el factor de coagulación activado y menos sustrato se disocia.

Estos métodos conocidos son métodos homogéneos. Los métodos de ensayo homogéneos tienen la ventaja de que la muestra se mezcla con los reactivos de detección para formar una mezcla de ensayo y la reacción de detección se mide en esta mezcla de ensayo sin necesidad de pasos de separación adicionales, por ejemplo, para separar el analito del resto de componentes de muestras. Los métodos de ensayo homogéneos también tienen, sin embargo, la desventaja que se encuentran presentes sustancias intrínsecas a la muestra durante todo el método de ensayo y, como resultado, puede afectar la reacción de detección o puede interferir con la medición de la reacción de detección. Las muestras de paciente pueden contener, por ejemplo en casos individuales, concentraciones anormalmente altas de una o de varias sustancias intrínsecas, es decir endógenas, las cuales demuestran ser interferentes al exceder una concentración tolerable en métodos de detección fotométrica y pueden producir un error sistemático. Se sabe que los problemas son causados por muestras de suero o plasma hemolíticas, ictéricas y/o lipémicas, las llamadas muestras HIL que tienen concentraciones altas anómalas de hemoglobina, bilirrubina y/o triglicéridos. Concentraciones altas anómalas de estas sustancias que interfieren pueden ser causadas por un estado patológico del paciente o sino por obtención o almacenamiento inapropiados de la muestra.

El objeto fundamental de la presente invención era proporcionar un método para determinar la actividad de factores de coagulación proteolíticos en una muestra el cual fuera menos susceptible de interferencia por parte de una sustancia perjudicial intrínseca a la muestra.

Este objeto se logra, según la invención, por el hecho que el método comprende los siguientes pasos:

a. proporcionar e incubar una mezcla de reacción que contiene

i. la muestra

ii. un agente para la activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico en la muestra,

iii. un sustrato disociable que presenta al menos un sitio de corte para el factor de coagulación activado,

iv. una fase sólida a la cual está enlazada o se enlaza el sustrato disociable durante la incubación;

b. Separar la fase sólida; y

c. Determinar la cantidad de sustrato enlazado a la fase sólida, no disociado por la incubación, con un reactivo que contiene sustancias que interactúan de modo específico con el sustrato no disociado y generan una señal medible.

La cantidad de sustrato enlazado a la fase sólida, no disociado, tiene una proporción inversamente proporcional a la actividad del factor de coagulación proteolítico a determinarse.

Proporcionar la mezcla de reacción siempre comprende poner en contacto la muestra, preferentemente una muestra de sangre o de plasma, con un agente para la activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico a determinar en la muestra y con una fase sólida. El sustrato disociable que tiene al menos un sitio de corte para el factor de coagulación activado puede introducirse a la mezcla de reacción de modos diferentes:

- El sustrato disociable, por ejemplo un péptido sintético o una proteína purificada, que no está enlazado a una fase sólida, puede estar contenido en un reactivo separado que se adiciona a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción contiene entonces una fase sólida a la cual se enlaza el sustrato disociable durante la incubación.

- El sustrato disociable, por ejemplo un péptido sintético o una proteína purificada, ya está enlazado a la fase sólida y se pone en contacto, junto con la fase sólida como componentes de la misma, con la muestra y el agente para la activación del factor de coagulación proteolítico.

- El sustrato disociable es un sustrato natural, contenido de manera natural en la muestra, para el factor de coagulación activado y de esta manera se introduce a la mezcla de reacción como componente del material de muestra con la muestra. La mezcla de reacción contiene entonces una fase sólida a la cual se enlaza el sustrato disociable natural durante la incubación.

Los sustratos disociables que tienen al menos un sitio de corte para un factor de coagulación activado son bastante conocidos para el experto en la materia. Un sustrato disociable puede ser una molécula sintética, producida de modo recombinante o por biotecnología o puede ser una molécula natural que se descompone en dos productos de disociación por acción del factor de coagulación activado. Un sustrato disociable puede componerse total o parcialmente de un péptido. Éste comprende preferiblemente una fracción de péptido al menos en la región del sitio de corte. La fracción de péptido de un sustrato disociable se compone preferiblemente de 3 hasta cerca de 150 residuos de aminoácidos.

En otra forma de realización, el sustrato disociable puede componerse de una proteína completa o de un fragmento de proteína. Un sustrato disociable también puede ser un sustrato natural de un factor de coagulación activado. Un ejemplo de un sustrato disociable natural es factor V, el cual tiene sitios de corte para proteína activada C, factor Xa, factor IIa (trombina) y plasmina. Otro ejemplo es fibrinógeno que tiene sitios de corte para factor IIa (trombina) . Un ejemplo más es factor II (protrombina) , que tiene sitios de corte para factor IIa (trombina)... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la actividad de un factor de coagulación proteolítica en una muestra; el método comprende los siguientes pasos:

a. proporcionar e incubar una mezcla de reacción que contiene

i. la muestra,

ii. un agente para la activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico en la muestra,

iii. un sustrato disociable que tiene al menos un sitio de corte para el factor de coagulación activado,

iv. una fase sólida a la que el sustrato disociable está enlazado o se enlaza durante la incubación;

b. Separar la fase sólida; y

c. Determinar la cantidad de sustrato no disociado, enlazado a la fase sólida mediante incubación de la fase sólida con un reactivo que contiene sustancias que interactúan de modo específico con el sustrato no disociado y generan una señal medible.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato disociable está contenido en un reactivo separado que se adiciona a la mezcla de reacción y en el que la mezcla de reacción contiene una fase sólida a la que el sustrato disociable se enlaza durante la incubación.

3. Método según la reivindicación 2 en el que el sustrato disociable comprende un péptido que se compone de 3 a 150 residuos de aminoácidos.

4. Método según la reivindicación 1 en el que el sustrato disociable es un sustrato natural para el factor de coagulación activado y un componente de la muestra y en el que la mezcla de reacción contiene una fase sólida a la que el sustrato disociable se enlaza durante la incubación.

5. Método según la reivindicación 1 en el que la mezcla de reacción contiene una fase sólida a la que el sustrato disociable está enlazado de modo covalente.

6. Método según la reivindicación 1 en el que el sustrato disociable tiene un primer participante de enlace A de un primer par de enlace A/B y en el que la fase sólida tiene el segundo participante de enlace B del primer par de enlace A/B y en el que el sustrato disociable está enlazado mediante un enlace de los participantes del enlace A y B a la fase sólida o se enlaza durante la incubación.

7. Método según la reivindicación 6 en el que los participantes de enlace A y B se seleccionan de tal modo que forman un par de enlace A/B del grupo FLAG-Tag/anti-FLAG-Tag-anticuerpo, HIS-Tag/anti-HIS-Tag-anticuerpo fluoresceína/anti-fluoresceína-anticuerpo.

8. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato disociable tiene un primer participante de enlace X de un segundo par de enlace X/Y y en el que el segundo participante de enlace Y del segundo par de enlace X/Y está asociado con un componente de un sistema generador de señal.

9. Método según la reivindicación 8 en el que los participantes de enlace X e Y se seleccionan de tal modo que forman un par de enlace X/Y del grupo de biotina/avidina, biotina/estreptavidina.

10. Método según una de las reivindicaciones precedentes en el que se usa un agente del grupo de tromboplastina, factor IIa, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor XIa, factor XIIa, proteína activada C, venenos de serpientes, fosfolípidos cargados negativamente, iones de calcio, factor de tejido, sílice, caolín, ácido elágico y celita para la activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico.

11. Método según una de las reivindicaciones precedentes en el cual se adiciona además un inhibidor de la agregación de fibrina a la mezcla de reacción.

12. Método según una de las reivindicaciones precedentes para la determinación de la actividad de un factor de coagulación proteolítico del grupo de factor II, factor VII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII y proteína C.