Procedimiento para detectar enfermedades que se basan en defectos de la proteína CFTR, reguladora de la conductancia a través de la membrana de la fibrosis quística.

Procedimiento in vitro para el diagnóstico de defectos en CFTR en una muestra de células sanguíneas quecomprende las siguientes etapas:

- desestabilización de la regulación del volumen dependiente de CFTR y

- discriminación entre células que presentan un defecto de la CFTR y células con CFTR intacta, por detección de laregulación del volumen de las células sanguíneas con CFTR intacta mediante la representación de la lisis celular.

Procedimiento para detectar enfermedades que se basan en defectos de la proteína CFTR, reguladora de la conductancia a través de la membrana de la fibrosis quística

La invención se refiere a procedimientos y a medios no genéticos de detección de enfermedades que se basan en defectos de la CFTR, en particular de la enfermedad fibrosis quística (en inglés, “cystic fibrosis” o CF) y reivindica la prioridad de los documentos de solicitudes de patentes alemanas 10208293.6 y 10216160.7 que se incorporan en esta memoria como referencia.

Diferentes enfermedades que se basan en defectos de la CFTR, como por ejemplo la fibrosis quística, la ausencia congénita del conducto deferente y algunas formas de pancreatitis, son bien conocidas. La fibrosis quística, también conocida como mucoviscidosis, representa una de las enfermedades más frecuentes de origen genético. La enfermedad se manifiesta con una frecuencia que varía regionalmente, de aproximadamente 1:2500 recién nacidos.

La fibrosis quística se hereda de forma autosómica recesiva y se debe a un defecto en el brazo largo del cromosoma

7. Está afectado el gen que codifica la proteína CFTR (reguladora de la conductancia a través de la membrana de la fibrosis quística) , una proteína de transporte a través de la membrana. El principal síntoma de esta enfermedad grave es un funcionamiento incorrecto general de los epitelios, de todas las glándulas exocrinas, de los pulmones y del tracto digestivo. La enfermedad se manifiesta por un aumento de la viscosidad de las secreciones de las glándulas mucosas en el pulmón y en el páncreas. En el curso progresivo de la enfermedad tienen lugar importantes cambios anatómicos, que tienen como consecuencia graves complicaciones en la región de las vías respiratorias, como por ejemplo infecciones crónicas con enfisema pulmonar y trastornos graves de la digestión (malabsorción) , con pérdidas de líquido y de electrolitos. El tratamiento de la fibrosis quística se lleva a cabo mediante sustitución enzimática, tratamiento específico con antibióticos y fisioterapia (masajes de percusión) . La enfermedad no es curable. Los pacientes con fibrosis quística padecen una limitación sustancial de su calidad de vida y, por lo general, llegan a una edad de aproximadamente 40 años, a pesar de la buena asistencia sanitaria actual.

La aparición de la enfermedad todavía no está determinada claramente. El gen afectado codifica un canal de cloruro localizado principalmente en la membrana de las células epiteliales. Se describe una variedad de mutaciones diferentes, que conducen a un aumento de la viscosidad de la mucosidad y a un cambio de la composición de las secreciones (Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, 258ª edición) . La mutación más frecuente es la deleción de fenilalanina en la posición 508 (LF508) . Además de la forma homocigota de la fibrosis quística, la enfermedad también se puede desarrollar en portadores de genes heterocigotos con diferentes grados de gravedad y también se puede desarrollar a una edad avanzada. Aproximadamente el 4% de la población blanca de Europa y de los EE.UU. es portadora de una mutación de CFTR heterocigota.

Por la bibliografía es conocido que en pacientes con FQ con la mutación homocigota LF508, la proteína CFTR no llega a la membrana plasmática de las células o se ancla de manera insuficiente en la membrana. Una proteína CFTR tal, es por ello incapaz de funcionar.

Por la bibliografía es conocido además, que la CFTR tiene una influencia sustancial sobre la regulación del volumen celular. En las células, en las que la función de la CFTR no está alterada, esta interviene en un mecanismo autocrino, que está dirigido por la liberación de ATP y la transmisión de la señal mediante ATP (adenosín trifosfato) , a través de un canal de iones separado. Un medio hipotónico produce un flujo de agua hacia adentro de la célula. La inflamación celular resultante, activa la CFTR, que a su vez libera un transporte de ATP desde la célula hacia afuera. El ATP extracelular activa los receptores purinérgicos, que impulsan en la célula a la fosfolipasa C (PLC) para la formación de inositol trifosfato (IP3) . El inositol trifosfato aumenta la concentración intracelular de iones calcio (Ca2+) . Una concentración intracelular elevada de iones calcio activa los canales de potasio y cloruro, dependientes de calcio, así como los canales para osmolitos, como por ejemplo taurina. Acto seguido, los iones de potasio y cloruro salen de la célula. Debido a esta pérdida neta de sales, el agua fluye detrás de forma osmótica. Como consecuencia, la célula se contrae (Braunstein, G. B. y col. The Journal of Biological Chemistr y , vol. 276, nº 9, edición del 2 de marzo, págs. 6621 a 6630, 2001) . Este proceso se denomina disminución regulada del volumen, del inglés: “regulator y volumen decrease” (RVD) . Se ha mostrado que los glóbulos rojos humanos después de una deformación mecánica, liberan ATP de forma dependiente de CFTR. (Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Kleinhenz ME, Lonigro AJ, ”Deformation-induced ATP release from red blood cell requires cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activity”. American Journal of Physiology, 275:H1726-H1732, 1988) . Se ha mostrado que en los medios hipotónicos, los glóbulos rojos de algunas especies regulan su volumen en función del ATP, sin embargo, los glóbulos rojos humanos no. (Light DS, Capes TL, Gronau RT, Adler MR. “Extracellular ATP stimulates volumen decrease in Necturus red blood cell”. American Journal of Physiology, septiembre, 277 (3 pt 1) :C480-91. 1999) .

Métodos de diagnóstico de la fibrosis quística:

1) Hasta ahora, el diagnóstico de la fibrosis quística se ha llevado a cabo, entre otros métodos, a través de una prueba de sudor en la que se determina la reabsorción de cloruro dependiente de CFTR de las células epiteliales de los conductos sudoríparos, mediante la medición de la concentración de cloruro en el sudor (documento de patente nº: WO00/13713 título: “Macroscopic sweat test for cystic fibrosis) . En pacientes con FQ, se encuentra un aumento de la concentración de cloruro. La prueba del sudor ofrece con frecuencia resultados poco claros. Además, es muy

larga y laboriosa y por lo tanto costosa.

2) Otros métodos son la medición de la tripsina inmunorreactiva que llega a la sangre por la insuficiencia pancreática de los pacientes con FQ (documento de Patente nº: AU 6445186. Título: “Detection of immunreactive tr y psin and cystic fibrosis using monoclonal antibody” y

3) la detección de un aumento del contenido en albúmina en el meconio (materia fecal infantil) de bebés (documento de Patente de EE.UU. nº: 3.902.847, título: “Diagnostic device and method for the diagnosis of mucoviscidosis (cystic fibrosis) ”) .

4) Además, el diagnóstico de la FQ se puede realizar mediante el análisis de la secreción de las glándulas salivales y por

5) la medición exacta, pero compleja, y por lo tanto poco aplicada hasta el momento, del potencial transepitelial en la mucosa nasal.

6) Una posibilidad adicional para el diagnóstico de la fibrosis quística es el reconocimiento de la mutación mediante el análisis directo del gen (documento de Patente nº WO94/15216. Título: “Detection of cystic fibrosis or a gene mutation”) . La investigación genética solo permite ciertamente unas conclusiones muy limitadas en relación con alteraciones funcionales. Hasta la fecha se conocen cientos de mutaciones diferentes de la CFTR, que conducen a un cuadro clínico más o menos definido. Sin embargo, en los análisis genéticos, solo se examinan aproximadamente 15 mutaciones diferentes, que causan solo un 80% de todas las enfermedades de FQ.

7) Se propuso un ensayo de FQ, en el que se tenía que medir el ATP liberado por eritrocitos mediante deformación mecánica, con un ensayo de luciferín-luciferasa. Este se basa en la observación de una relación entre CFTR y la secreción de ATP. (Verloo, P. y col., Pediatric Pulmonology, supl. 20:72 (2000) ) .

8) Otros métodos se basan en las diferencias entre FQ y no FQ, en la cinética de algunas enzimas, como por ejemplo, la deshidrogenasa de NADH de las mitocondrias (documento de Patente: PCT/US80/00370, título: “Cystic fibrosis detection method”) , que se puede medir por ejemplo en el material homogeneizado de linfocitos.

9) La enzima... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para el diagnóstico de defectos en CFTR en una muestra de células sanguíneas que comprende las siguientes etapas:

- desestabilización de la regulación del volumen dependiente de CFTR y

- discriminación entre células que presentan un defecto de la CFTR y células con CFTR intacta, por detección de la regulación del volumen de las células sanguíneas con CFTR intacta mediante la representación de la lisis celular.

2. Procedimiento para el diagnóstico de defectos de CFTR de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por la activación (apertura) o la inhibición de un canal de la membrana dependiente de CFTR.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por una hemolisis de las células sanguíneas con CFTR intacta y por una falta de hemolisis en las células sanguíneas que presentan un defecto de la CFTR.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por un procedimiento óptico luminoso para la cuantificación de la hemolisis.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por un recuento de los reticulocitos en el frotis para el registro de la hemolisis.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de un inhibidor de la liberación de ATP para inhibir la regulación del volumen.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de un inhibidor de los canales catiónicos activables por extensión (SAC) .

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por el uso de Gd3+ como inhibidor.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por un agente de activación (apertura) del canal iónico dependiente de CFTR (SDAC) .

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por un derivado de estilbeno como agente de activación.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por ácido 4-amino-4’-isotiocianato-estilben-2, 2’disulfónico del mismo como agente de activación.

12. Uso de un derivado de estilbeno para activar el canal iónico dependiente de CFTR, SDAC, en células sanguíneas in vitro.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 11, caracterizado por la determinación del grado de gravedad de la fibrosis quística mediante comparaciones cuantitativas.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 9-10, 13, caracterizado por el uso de ácido 4amino-4’-isotiocianato-dihidroestilben-2, 2’-disulfónico como agente de activación.

15. Equipo de reactivos para diagnóstico que contiene ácido 4-amino-4’-isotiocianato-dihidroestilben-2, 2’disulfónico.

16. Compuesto químico de fórmula general