UN PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN Y/O IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS DE VIRUS ADENO-ASOCIADOS (AAV) Y AISLAMIENTO DE NUEVAS SECUENCIAS ASÍ IDENTIFICADAS.

Un procedimiento de detección y/o identificación de secuencias de virus adeno-asociados (AAV) y aislamiento de nuevas secuencias así identificadas Antecedentes de la invención El virus adeno-asociados (AAV), un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura con genomas de ADN lineales de cadena simple de 4,7 kilobases (kb) hasta 6 kb. El AAV está asignado al género Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como un contaminante en poblaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase a latente cuyos genomas de AAV, tras la infección, son el sitio específicamente integrado en cromosomas anfitrión y en fase infecciosa en la que, a continuación de la infección por virus ya sea de adenovirus o ya sea de herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no-patogenicidad, gama de infectividad de anfitrión amplia, incluyendo las células que no se dividen, y la potencial integración cromosómica específica del sitio, hacen del AAV una herramienta atractiva para la transferencia de gen. Estudios recientes sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido para terapia genética. Hasta la fecha, han existido 6 serotipos diferentes de AAVs aislados en humanos o en primates no humanos (NHP) y bien caracterizados. Entre ellos, el serotipo 2 humano es el primer AAV que fue desarrollado como un vector de transferencia de gen; éste ha sido ampliamente utilizado para experimentos eficaces de transferencia de gen en diferentes tejidos objetivo y en modelos animales. Los ensayos clínicos de la aplicación experimental de vectores basados en AAV2 a algunos modelos de enfermedades humanas, están avanzando e incluyen enfermedades tales como fibrosis quística y hemofilia B. Lo que se desea son construcciones basadas en AAV para suministro de gen. Sumario de la invención La invención proporciona nuevos serotipos de AAV, vectores que contienen a los mismos, y procedimientos, según se define en las reivindicaciones anexas. Estos y otros aspectos de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada de la invención que se realiza en lo que sigue. Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1A a IAAAR proporcionan un alineamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican al menos las proteínas cap para los serotipos de AAV. Las secuencias de longitud completa incluyendo las ITRs, la región rep, y la región de cápside, se proporcionan para el serotipo 7 de AAV [SEQ ID NO. 1], y para el AAV1 [SEQ ID NO. 6], el AAV2 [SEQ ID NO. 7] y el AAV3 [SEQ ID NO. 8] previamente publicados; Nuevos serotipos de AAV, el AAV8 [SEQ ID NO. 4] y el AAV9 [SEQ ID NO. 5] son el objeto de solicitudes depositadas simultáneamente. Los otros clones novedosos proporcionadas en este alineamiento incluyen: 42-2 [SEQ ID NO. 9], 42-8 [SEQ ID NO. 27], 42-15 [SEQ ID NO. 28], 42-5b [SEQ ID NO. 29], 42-1b [SEQ ID NO. 30]; 42-13 [SEQ ID NO. 31], 42-3a [SEQ ID NO. 32], 42-4 [SEQ ID NO. 33]. 42-5a [SEQ ID NO. 34], 42-10 [SEQ ID NO. 35]. 42-3b [SEQ ID NO. 36], 42-11 [SEQ ID NO. 37], 42-6b [SEQ ID NO. 38], 43-1 [SEQ ID NO. 39], 43-5 [SEQ ID NO. 40], 43-12 [SEQ ID NO. 41], 43-20 [SEQ ID NO. 42]. 43-21 [SEQ ID NO. 43], 43-23 [SEQ IDNO. 44], 43-25 [SEQ ID NO. 45], 44.1 [SEQ ID NO. 47], 44.5 [SEQ ID NO. 47], 223.10 [SEQ ID NO. 48], 223.2 [SEQ ID NO. 49], 223.4 [SEQ ID NO. 50], 223.5 [SEQ ID NO.51], 223.6 [SEQ ID NO. 52], 223.7 [SEQ ID NO. 53], A3.4 [SEQ ID NO. 54], A3.5 [SEQ ID NO. 55], A3.7 [SEQ ID NO. 56], A3.3 [SEQ ID NO. 57], 42.12 [SEQ ID NO. 58], 44.2 [SEQ ID NO. 59]. Las secuencias de nucleótido de las regiones de signatura de AAV10 [SEQ ID NO. 117], AAV11 [SEQ ID NO. 118] y AAV12 [SEQ ID NO. 119], se proporcionan en esta Figura. Se muestran puntos de referencia críticos en las estructuras de genomas de AAV. Las separaciones se manifiestan mediante puntos. La ITR 3 de AAV1 [SEQ ID NO. 6] se muestra con la misma configuración que en las secuencias publicadas. TRS representa el sitio de resolución terminal. Obsérvese que AAV7 es el único AAV del que se ha informado que utilice GTG como el codón de iniciación para VP3. Las Figuras 2A a 2F son un alineamiento de secuencias de aminoácido de las proteínas de las proteínas de cápside vp1 de serotipos 1 de AAV [SEQ ID NO. 64], AAV2 [SEQ ID NO. 70], AAV3 [SEQ ID NO. 71], AAV4 [SEQ ID NO. 63], AAV5 [SEQ ID NO. 114], y AAV6 [SEQ ID NO. 65] previamente publicados y de las nuevas secuencias de AAV de la invención, incluyendo: C1 [SEQ ID NO. 60], C2 [SEQ ID NO. 61], C5 [SEQ ID NO. 62], A3-3 [SEQ ID NO. 66], 13-7 [SEQ ID NO. 67], A3-4 [SEQ ID NO. 68], 13-5 [SEQ ID NO. 69], 3,3b [SEQ ID NO. 62], 223.4 [SEQ ID NO. 73], 223-5 [SEQ ID NO. 74], 223-10 [SEQ ID NO. 75], 223-2 [SEQ ID NO. 76], 223-7 [SEQ ID NO. 77], 223-6 [SEQ ID NO. 78], 44-1 [SEQ ID NO. 79], 44-5 [SEQ ID NO. 80], 44-2 [SEQ ID NO. 81], 42-15 [SEQ ID NO. 84], 42-8 [SEQ ID NO. 85], 42-13 [SEQ ID NO. 86], 42-3A [SEQ ID NO. 87], 42-4 [SEQ ID NO. 88], 42-5A [SEQ ID NO. 89], 42-IB [SEQ ID NO. 90], 42-5B [SEQ ID NO. 91], 43-1 [SEQ ID NO. 92], 43-12 [SEQ ID NO. 93], 43-5 [SEQ ID NO. 94], 43-21 [SEQ ID NO. 96], 43-25 [SEQ ID NO. 97], 43-20 [SEQ ID NO. 99], 24.1 [SEQ ID NO. 101], 42.2 [SEQ ID NO. 102], 7.2 [SEQ ID NO. 103], 27.3 [SEQ ID NO. 104], 16.3 [SEQ ID NO. 105], 42.10 [SEQ ID NO. 106], 42-3B [SEQ ID NO. 147], 42-11 [SEQ ID NO. 102], F1 [SEQ ID NO. 109], F5 [SEQ ID NO. 110], F3 [SEQ ID NO. 111], 42-6B [SEQ ID 2  5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55  NO. 112], 42-12 [SEQ ID NO. 113]. Los nuevos serotipos AAV8 [SEQ ID NO. 95] y AAV9 [SEQ ID NO. 100] son el objeto de solicitudes de patentes depositadas simultáneamente. Las Figuras 3A a 3C proporcionan las secuencias de aminoácido de las proteínas rep de AAV7 [SEQ ID NO. 3]. Descripción detallada de la invención La invención se refiere a secuencias de ácido nucleico identificadas de acuerdo con los procedimientos que se describen en la presente memoria. Uno de tales virus adeno-asociados es un serotipo nuevo, denominado en la presente memoria serotipo 7 (AAV7). Otros nuevos serotipos de virus adeno-asociado proporcionados en la presente memoria incluyen el AAV10, el AAV11 y el AAV12. Incluso se proporcionan en la presente descripción otros nuevos serotipos de AAV identificados de acuerdo con los procedimientos de la invención. Véase, Listado de Figuras y Secuencias, que se incorpora por referencia. También se proporcionan fragmentos de estas secuencias de AAV. Entre los fragmentos de AAV particularmente deseables están las proteínas cap, incluyendo la vp1, vp2, vp3, las regiones hipervariables, las proteínas rep, incluyendo la rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40, y las secuencias que codifican a estas proteínas. Cada uno de estos fragmentos puede ser utilizado fácilmente en una diversidad de sistemas de vector y células anfitrión. Tales fragmentos pueden ser usados solos, en combinación con otras secuencias o fragmentos de AAV, o en combinación con elementos de las otras secuencias virales de AAV o no-AAV. En una realización particularmente deseable, un vector contiene las secuencias cap y/o rep de AAV de la invención. Según se describe en la presente memoria, se realizan alineamientos utilizando cualquiera de una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiple disponibles públicamente o comercialmente, tal como el Clustal W, accesible a través de Servidores Web en Internet. Alternativamente, se utilizan también utilidades de Vector NTI. Éstas son también un número de algoritmos conocidos en la técnica que pueden ser utilizados para medir identidad de secuencia de nucleótido, incluyendo las contenidas en los programas descritos en lo que antecede. Según otro ejemplo, las secuencias de polinucleótido pueden ser comparadas utilizando Fasta, un programa en GCG, Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda y consulta. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado utilizando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se proporciona en GCG Versión 6.1. Se encuentran disponibles programas similares para secuencias de aminoácido, por ejemplo el programa Clustal X. En general, cualquiera de estos programas se utiliza en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar estas configuraciones según se necesite. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y los programas referenciados. El término homología sustancial... [Seguir leyendo]

1.- Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende un cápside de AAV que tiene una secuencia de aminoácido AAV7, aminoácidos de 1 a 137 de SEQ ID No. 2 o una secuencia que es al menos idéntica en un 95% con la misma; y un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión. 2.- El AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las ITRs son del AAV 2. 3.- Una proteína de cápside aislada que comprende proteína de AAV7 seleccionada en el grupo consistente en: proteína de cápside vp2, aminoácidos (aa) 138 a 737 de SEQ ID No. 2, y proteína de cápside vp3, aa 203 a 737 de SEQ ID No. 2. 4.- Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende un cápside de AAV que comprende al menos vp3 de AAV7 que tiene la secuencia de aa de 203 a 737 de SEQ ID No. 2 o una secuencia que es al menos idéntica en un 95% con la misma; y un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente con secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión. 5.- Una molécula de ácido nucleico aislada o sintética que codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 3. 6.- Una molécula de ácido nucleico aislada o sintética que codifica una nueva proteína de cápside de virus adenoasociado (AAV) 7, que tiene una secuencia de aminoácido de 1 a 737 de SEQ ID No. 2. 7.- Una molécula de ácido nucleico aislada o sintética que codifica un fragmento de una proteína de cápside de virus adeno-asociado 7, estando la citada secuencia de ácido nucleico elegida en el grupo consistente en: vp1, nt 2222 a 4435 de SEQ ID No. 1; vp2, nt 2633 a 4435 de SEQ ID No. 1, y vp3, nt 2831 a 4435 de SEQ ID No. 1. 8.- Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que dicha molécula es un plásmido. 9.- Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que dicha molécula comprende además un gen rep funcional de AAV. 10.- Un procedimiento de generación de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende un cápside de serotipo de AAV, que comprende las etapas de cultivar una célula anfitrión que contiene: (a) una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que codifica un cápside de virus adeno-asociado; (b) un gen rep funcional; (c) un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV. 11.- Una célula anfitrión in vitro transfectada con un virus adeno-asociado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o con una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9. 12.- Una composición que comprende un AAV de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 4, y un portador fisiológicamente compatible. 13.- Una composición que comprende una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y un portador fisiológicamente compatible. 14.- Una proteína rep aislada o sintética adeno-asociada de (AAV) 7 o un fragmento de la misma seleccionado en el grupo consistente en aminoácido (aa) 1 a 623, aa 1 a 171; aa 172 a 372, y aa 445 a 623 de SEQ ID No. 3. 15.- Una molécula aislada o sintética de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido de serotipo 7 de virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicación 14. 379      380        381        382        383        384        385        386        387        388        389        390        391        392        393        394      395        396        397        398        399        400        401        402        403        404        405        406        407        408        409        410        411        412        413        414        415        416        417        418        419        420        421        422        423        424        425        426        427        428        429        430        431        432        433        434        435        436        437        438        439        440        441        442        443        444        445        446        447        448        449        450        451        452        453        454        455        456        457        458        459        460        461        462        463        464        465        466        467        468        469        470        471        472        473        474        475        476        477        478        479        480        481        482        483        484