DETECCIÓN ESPECÍFICA DEL GENOTIPO DE CHLAMYDOPHILA PSITTACI.

Detección específica del genotipo de Chlamydophila psittaci Campo de la invención La presente invención se refiere a la detección cualitativa y cuantitativa de genotipos de Chlamydiaceae así como a la detección y el diagnóstico de infecciones bacterianas en mamíferos, incluidos seres humanos y aves. La invención se refiere, además, a la detección de una nueva cepa de una bacteria infecciosa. Antecedentes de la invención Bacterias de la familia de las Chlamydiaceae son parásitos intracelulares obligados de células eucarióticas. En animales, las Chlamydophilae son capaces de inducir un amplio espectro de síntomas tales como enteritis, infección urogenital, aborto, neumonía, poliartritis, poliserositis, encefalitis y mastitis. Chlamydophila (Cp.) psittaci (anteriormente Chlamydia psittaci) provoca enfermedades respiratorias en aves y la psitacosis o fiebre del loro en hombres. Hasta ahora, la detección de Cp. psittaci en muestras de aves se ha llevado a cabo de forma rutinaria mediante visualización directa de los organismos utilizando tinciones citológicas, mediante el aislamiento en cultivo de células o huevos embrionados específicos, exentos de patógenos, mediante detección de antígenos de Cp. psittaci o mediante ensayos serológicos de medición de anticuerpos. Las tinciones citológicas tienen una deficiente sensibilidad y especificidad y solamente se pueden utilizar como un método de investigación preliminar rápido. La desventaja principal del aislamiento es la necesidad de bacterias viables. Esto significa requisitos especiales para la recogida y el almacenamiento de muestras, requisitos que no siempre se pueden cumplir cuando se recogen muestras en el campo. Además, el aislamiento es laborioso y costoso y únicamente se puede realizar en laboratorios con un nivel de bioseguridad específico, ya que Cp. psittaci es un agente zoonótico que se esparce mediante aerosol. Los actuales métodos de detección de antígenos rápidos no se recomiendan para demostrar Cp. psittaci en aves individuales debido a defectos en la sensibilidad o especificidad. La serología no es particularmente útil para diagnosticar una infección activa por Cp. psittaci en aves, debido al alto predominio de esta infección en aves y a la persistencia durante largo tiempo (de hasta varios meses) de anticuerpos anti-Cp. psittaci. Además, la detección de anticuerpos basada en utilizar organismos completos, los LPS (lipopolisacáridos) o fracciones de la membrana externa, pueden generar falsos positivos debido a la presencia de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con los LPS de Cp. psittaci o proteínas de choque térmico. De manera importante, los actuales ensayos de detección de anticuerpos de Cp. psittaci no pueden utilizarse para demostrar una infección por Cp. psittaci en hombres, dado que los seres humanos también pueden verse infectados con otros miembros de las Chlamydiaceae tal como Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumonieae, (anteriormente Chlamydia pneumoniae) y Chlamydophila abortus (anteriormente psittaci serotipo 1) que pueden provocar resultados falsos positivos. El diagnóstico de la infección con Cp. psittaci ha sido difícil y engorroso. Hasta ahora, la detección de Cp. psittaci en muestras de aves se realiza con ensayos serológicos, proporcionando, tal como se ha indicado arriba, solamente información retrospectiva. Cp. psittaci ha sido clasificada en seis serovares de aves (A a F) utilizando un panel de anticuerpos monoclonales específicos para serovares contra la proteína principal de la membrana externa (MOMP siglas en inglés). La MOMP es codificada por el gen OmpA, y el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP siglas en inglés) de OmpA revela seis genotipos correspondientes. Hasta ahora, los genotipos A, C, y D son los genotipos más comunes asociados con la psitacosis humana. SUDLER et al. (Molecular characterisation of chlamydial isolates from birds. VETERINARY MICROBIOLOGY, 2004) describe un método in vitro para la identificación de ADN de los genotipos A, B, F y G de C. psittaci, utilizando 2 oligonucleótidos específicos para OmpA, seguido de una digestión por restricción. Las muestras proceden de aves. Mientras que el análisis de RFLP del gen OmpA que codifica la MOMP permite una detección específica de los genotipos de Cp. psittaci, patrones de restricción en el RFLP son a veces difíciles de analizar, y la amplificación de OmpA no siempre se puede llevar a cabo directamente en muestras clínicas. Además de ello, este método requiere la amplificación del gen OmpA de 1200 pb completo, la cual fracasa a menudo cuando está disponible una cantidad limitada de ADN. La microinmunofluorescencia indirecta (IMIF siglas en inglés) con anticuerpos monoclonales requiere siempre un cultivo y, por lo tanto, es costosa y laboriosa y, en definitiva, es menos sensible que la determinación del genotipo por medio de RFLP o el análisis de la secuencia de OmpA completa. Aparte de los problemas de diagnóstico entre especies en los ensayos serológicos y las dificultades dentro de la misma especie cuando se trata con infecciones mixtas en RFLP o el serotipado, estos ensayos tienen todos el problema de que no proporcionan información sobre el número real de partículas infecciosas en la muestra, haciendo también difícil o imposible seguir un tratamiento o averiguar el origen de una infección. La presente perspectiva ilustra la necesidad de un ensayo diagnóstico específico para determinar el genotipo de Cp. psittaci en aves y mamíferos, incluido el hombre. Un ensayo de este tipo debería ser rápido y sensible. 2   Sumario de la invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un método ex vivo o in vitro para la identificación de la presencia de uno o más genotipos de Cp. psittaci en una muestra. Así, la presente invención proporciona un método para la determinación de la presencia de Cp. psittaci en una muestra, así como un método para identificar específicamente entre los diferentes genotipos de Cp. psittaci, qué genotipo está presente en la muestra, permitiendo así la determinación del agente activamente infeccioso, incluso cuando las muestras se toman de un animal o ser humano que ha sido previamente infectado con Cp. psittaci. Una realización específica de la invención se refiere a un método para detectar un nuevo genotipo de Cp. psittaci, al que se alude como genotipo EB. Realizaciones adicionales de la invención se refieren a métodos para detectar e identificar la presencia de los genotipos A, B, C, D, E y F. De acuerdo con una realización específica adicional, el método ex vivo o in vitro para la detección y/o identificación de la presencia de ADN de un genotipo de Cp. psittaci en una muestra comprende las etapas de (a) incubar la muestra con un primer oligonucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a ADN de un genotipo de Cp. psittaci, y (b) determinar la unión del primer oligonucleótido a ADN dentro de la muestra, unión que es indicativa de la presencia de ADN de un genotipo de Cp. psittaci en esa muestra. De acuerdo con realizaciones específicas de la invención, la detección y/o identificación se realizan utilizando un primer nucleótido que comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos del gen OmpA de uno de los genotipos de Cp. psittaci, más específicamente que comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos dentro de la región desde aproximadamente el nucleótido 450 a aproximadamente el nucleótido 600 o desde aproximadamente el nucleótido 900 hasta aproximadamente el 1100 de la secuencia de OmpA correspondiente al acceso de GB AF269281 [SEQ ID. NO: 54], que es esencialmente idéntica a una secuencia de 15 nucleótidos dentro del gen OmpA, más particularmente dentro de estas regiones del gen OmpA. Realizaciones más particulares de la invención comprenden métodos, en los que el primer oligonucleótido específico para el genotipo se selecciona del grupo que consiste en la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1 para el genotipo A, la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 2 para el genotipo B, la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 3 para el genotipo C, la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 4 para el genotipo D, la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 5 para el genotipo E, la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 6 para el genotipo F y la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 25 para el genotipo EB o una secuencia esencialmente idéntica a ella, capaz de hibridarse específicamente al genotipo respectivo. Un oligonucleótido de este tipo se puede marcar, p. ej., con un grupo cromóforo en su extremo 5 y con un grupo extintor de fluorescencia en su extremo 3. Una realización particular de la invención se refiere a la identificación de un genotipo particular de Cp. psittaci en una muestra. Se prevé, además, que en realizaciones... [Seguir leyendo]

1.- Un método es vivo o in vitro para la identificación de la presencia de ADN de un genotipo de Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci) en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de: - incubar dicha muestra con un primer oligonucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a ADN de un genotipo de Cp. psittaci, incubar dicha muestra con al menos un segundo oligonucleótido que es un oligonucleótido competidor, que comprende una secuencia correspondiente a una secuencia dentro del ADN de un genotipo de Cp. psittaci distinto del genotipo al que está dirigido la primera sonda, que puede ser alineado con la secuencia de dicha primera sonda, y - determinar la unión de dicho primer oligonucleótido a ADN dentro de dicha muestra, unión que es indicativa de la presencia de ADN de un genotipo de Cp. psittaci en dicha muestra. 2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho primer nucleótido comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos del gen OmpA de uno de los genotipos de Cp. psittaci. 3.- El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho primer nucleótido comprende una secuencia de al menos 15 nucleótidos dentro de la región desde el nucleótido 450 al nucleótido 600 o desde el nucleótido 900 al 1100 de la secuencia OmpA correspondiente al acceso de GB AF269281 y representada en SEQ ID NO: 54. 4.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho genotipo de Cp. psittaci se selecciona de los genotipos A, B, C, D, E, F y EB, en donde el genotipo EB se caracteriza porque comprende la secuencia OmpA representada en SEQ ID NO: 51. 5.- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho primer oligonucleótido se marca con un grupo cromóforo en su extremo 5 y con un grupo extintor de fluorescencia en su extremo 3. 6.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra se incuba con más de un primer oligonucleótido, y en el que cada uno de dichos más de un primer nucleótido es capaz de hibridarse a ADN de un genotipo de Cp. psittaci. 7.- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1 para el genotipo A, - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 2 para el genotipo B, - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 3 para el genotipo C, - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 4 para el genotipo D, - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 5 para el genotipo E, - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 6 para el genotipo F, y - secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 24 para el genotipo EB, en el que el genotipo EB se caracteriza porque comprende la secuencia OmpA representada en SEQ ID NO: 51, o una secuencia que difiere en uno a tres nucleótidos de las secuencias proporcionadas, capaces de hibridarse específicamente a dicho genotipo. 8.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho primer y dicho segundo oligonucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en: - dicho segundo oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 y dicho primer oligonucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, - dicho segundo oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 y dicho primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID. NO: 2; - dicho segundo oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO:10 y en el que dicho primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID. NO: 2; - dicho segundo oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y dicho primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID. NO: 5; - dicho segundo oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO:11 y dicho primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID. NO: 5. 9.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la unión de dicho primer oligonucleótido se determina mediante amplificación por PCR con un cebador directo y un cebador inverso. 10.- El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dichos cebadores directo e inverso están situados aproximadamente 1 a 100 pb de 3 y 5 de dicho primer oligonucleótido. 26   11.- El método de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el dichos cebadores directo e inverso para dicha amplificación por PCR de dicho primer oligonucleótido se seleccionan del grupo que consiste en - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1; - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2; - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3; - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4; - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5; - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6; - cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 cuando el primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24; o cebadores que tienen una secuencia que difiere como máximo en 5 nucleótidos de dichos cebadores sin afectar a su capacidad de actuar como un cebador para amplificación por PCR. 12.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha muestra es de un ave. 13.- El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho ave se encuentra en la fase de desarrollo en la que desaparece la inmunidad materna de dicho ave. 14.- El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho ave es un pato de aproximadamente 6 semanas después de la eclosión. 15.- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, que es un método para identificar específicamente el genotipo de Cp. psittaci presente en la muestra. 16.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para determinar la eficacia de un tratamiento contra una infección por Cp. psittaci. 17.- Un kit de diagnóstico para la identificación de la presencia de ADN de un genotipo de Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci) en una muestra, que comprende las sondas específicas para el genotipo y sondas competidoras: - oligonucleótido específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, y oligonucleótido competidor específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8; - oligonucleótido específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, y oligonucleótido competidor específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7; - oligonucleótido específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, y oligonucleótido competidor específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10; - oligonucleótido específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5, y oligonucleótido competidor específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9; y - oligonucleótido específico para el genotipo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5, y oligonucleótido competidor específico para el genotipo, dicho primer oligonucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11. 18.- El kit diagnóstico de la reivindicación 17, que comprende uno o más de los oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. 19.- Uso de sondas específicas para el genotipo en combinación con sondas competidoras para la identificación ex vivo o in vitro de un genotipo de Cp. psittaci, en donde dicha sonda competidora comprende una secuencia correspondiente a una secuencia dentro del ADN de un genotipo de Cp. psittaci distinto del genotipo a la que está dirigido la sonda específica para el genotipo, que se puede alinear con la secuencia de dicha sonda específica para el genotipo. 20.- El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la identificación de dicho genotipo es para el diagnóstico y el seguimiento del tratamiento de infecciones por Cp. psittaci de muestras respiratorias de seres humanos. 27   28   29     31