Un procedimiento para la detección electroquímica de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende:

(a) proporcionar un dispositivo para detectar la presencia del ácido nucleico diana, comprendiendo dichodispositivo un nanoelectrodo, en el que el nanoelectrodo comprende al menos un nanohilo metálico integradodentro de una membrana de policarbonato y una sonda de ácido nucleico unida al nanohilo metálico;

(b) poner encontacto la sonda de ácido nucleico con la muestra y una solución que comprende un compuesto de unión aácido nucleico bajo una condición de hibridación;

(c) generar una señal de la interacción electrostática entre lasonda de ácido nucleico y el compuesto de unión a ácido nucleico;

(d) poner en contacto la sonda de ácidonucleico con una solución que comprende una sonda activa redox;

(e) amplificar la señal generada con la sondaactiva redox; y

(f) medir la señal amplificada, en el que un incremento de la señal amplificada detectada conrelación a una señal amplificada de una muestra de control que no comprende ácido nucleico diana es indicativode la presencia del ácido nucleico diana en la muestra.

Detección de hibridación de ácidos nucleicos electrocatalítica

Antecedentes

La aplicación de la información genética disponible recientemente a los avances en la medicina preventiva y en el tratamiento de enfermedades requiere tecnologías de detección de ADN eficientes y exactas.1, 2 Uno de los objetivos de los desarrollos tecnológicos recientes es el de sistemas que exploten la hibridación de ADN diferencial en superficies sólidas.3-6 En teoría, la hibridación de secuencias diana que representan fragmentos genómicos microbianos o genes relacionados con enfermedades humanas para inmovilizar secuencias de sondas permitiría una detección de ADN de alta sensibilidad y de alto rendimiento. Además, si se pudieran discriminar secuencias estrechamente relacionadas, se podrían detectar e identificar patógenos microbianos.

Se puede usar una variedad de técnicas espectroscópicas y analíticas para detectar la hibridación de ADN en superficies.7-22 Se pueden usar nanopartículas de oro modificadas con ADN para detectar secuencias de ADN usando espectroscopía óptica y de fluorescencia.12, 18 La resonancia de plasmón superficial también proporciona un medio para monitorizar la hibridación de secuencias diana con sustratos de oro modificados con ADN en tiempo real.3, 4, 19, 20, 22 Los resultados obtenidos con estos procedimientos indican que se puede lograr la detección de ADN con alta sensibilidad cuando se usan oligonucleótidos movilizados para capturar secuencias de una solución.

Otros procedimientos de detección de genes (por ejemplo, la patente de los EE. UU. N.º 5.972.692, y la patente de los EE. UU. N.º 5.312.527) no usan un ensayo electrocatalítico para la detección de hibridación de ADN.

La detección de secuencias de ADN usando una lectura electroquímica es particularmente atractiva para el desarrollo de diagnósticos clínicos.2, 6, 23, 24 Se pueden realizar medidas electroquímicas cuantitativas de este tipo usando instrumentación compacta y económica, y normalmente es innecesario usar muestras de ADN marcadas covalentemente con grupos indicadores, simplificando los procedimientos de preparación de muestras. De hecho, se ha informado de varios procedimientos para la detección electroquímica de ADN, la mayoría de los cuales se basan en la señal producida por un grupo indicador activo redox unido no covalentemente que se incrementa cuando se hibrida sonda.7-11, 13, 15, 21

el ADN a una superficie modificada con una secuencia de Además, se pueden detectar electroquímicamente sustituciones de bases sueltas que producen emparejamientos inadecuados de bases dentro de dúplex de ADN inmovilizados sobre superficies de oro usando sondas intercalantes.14, 16 La interrupción del apilamiento de bases provocada por el emparejamiento inadecuado atenúa el flujo de corriente al indicador interfiriendo el acoplamiento electrónico mediado por ADN. Este efecto permitiría potencialmente la detección electroquímica de mutaciones puntuales relacionadas con enfermedad.

Los procedimientos electrocatalíticos que amplifican las señales obtenidas en las superficies de electrodos modificados con ADN proporcionan un medio poderoso para incrementar la sensibilidad y precisión de un ensayo de detección. El Ru (bpy) 33+ generado electroquímicamente reacciona con guaninas contenidas dentro de una diana hibridada en un procedimiento catalítico que genera señales grandes que se pueden usar para detectar la hibridación de ADN, aunque con limitaciones debido a la dependencia de la secuencia.13, 15, 21, 24 Además, se ha usado una reacción electrocatalítica entre una sonda intercalante, azul de metileno y Fe (CN) 63- transmitido en solución para amplificar los cambios de señal que informan de la presencia de mutaciones puntuales que producen emparejamiento inadecuado.16 Sin embargo, ninguno de los sistemas es ideal para una detección basada en hibridación de secuencias estrechamente relacionadas.

Lapierre et al.4 da a conocer una detección electroquímica (esquema 1, fig. 1) de un ácido nucleico diana usando un compuesto activo redox de rubidio que se une a ADN de forma no específica a través de interacciones electrostáticas con el esqueleto de fosfato lo que proporciona una señal que informa del incremento de grupos cargados negativamente en la superficie del electrodo después de la hibridación de una secuencia diana. La señal se amplifica por un oxidante de Fe (III) , lo que permite que se genere Ru (III) para múltiples ciclos redox.

Keohne et al. (Nanotechnology 14 (2003) 1239-1245) da a conocer una detección de ácidos nucleicos usando nanohilos integrados en una matriz de sílice. Ferain et al. (Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section - B-beam interactions with materials and atoms, Elsevier NL, vol. 208, 1 de agosto de 2003) da a conocer el desarrollo de plantillas basadas en policarbonato nanoporoso.

Sumario de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la detección electroquímica de un ácido nucleico diana en una muestra de acuerdo con la reivindicación 1.

La invención también proporciona procedimientos para la detección electroquímica de hibridación de ácidos nucleicos en de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 5.

Las características adicionales de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes 6 a 17.

Breve descripción de los dibujos

LA FIG. 1 es una ilustración de una detección electrocatalítica de hibridación de ADN de una secuencia de H. pylori.

La FIG. 2A y 2B muestra una detección de hibridación electrocatalítica de la secuencia Hpn a partir de H. pylori. FIG. 2A: sin diana. A FIG. 2B: con diana.

La FIG. 3 es un histograma que muestra la reproducibilidad de la detección de hibridación electrocatalítica. Las pruebas descritas a continuación y mostradas en la FIG. 2 se realizaron en cuatro días diferentes.

La FIG. 4 es una ilustración de una detección electrocatalítica de hibridación de ADN.

Las FIG. 5A, 5B y 5C son un par de voltamogramas y un gráfico de barras. La FIG. 5A es un voltamograma cíclico que ilustra la potenciación de la señal electrocatalítica después de la hibridación de la secuencia diana. La señal inicial se muestra como un trazo de puntos, y la señal obtenida después de la introducción de la diana se muestra como una línea continua. La FIG. SB es un voltamograma obtenido con los mismos electrodos pero sólo en presencia de Ru (III) , que presenta un incremento de señal muy pequeño después de la introducción de la diana. La FIG. 5C muestra la detección de secuencias relacionadas con H. pylori monitorizando la carga integrada. Los datos presentados corresponden a un cambio en la carga después de 30 minutos de hibridación.

La FIG. 6 es un gráfico de barras que muestra la dependencia con el tiempo de la hibridación para las secuencias de WT y A2143C correspondientes a un fragmento del ARNr 23S de H. pylori.

La FIG. 7 es un gráfico de barras que muestra la dependencia con el tiempo de la hibridación para una sonda de HP2a (sonda de Hpn complementaria) y una sonda de HP2b (sonda de Hpn no complementaria) .

La FIG. 8 es una electrocatálisis de Ru (III) /Fe (III) como indicador de ADN inmovilizado en superficie. (A) Dependencia de electrocatálisis sobre cobertura de superficie de ADN. Se prepararon películas de ADN con densidades variables variando la concentración de MgCl2 durante la exposición de sustratos de oro a soluciones de la sonda. Se muestran voltamogramas cíclicos obtenidos en electrodos modificados en presencia de MgCl2 10 (línea de puntos) , 30 (línea de guiones) y 100 (línea continua) mM. (B) Voltamogramas cíclicos que ilustran la potenciación de la señal electrocatalítica después de la hibridación de T2a (la línea de puntos corresponde al VC obtenido prehibridación, la línea continua corresponde al VC obtenido después de la hibridación) . Se prepararon películas de ADN en presencia de MgCl2 50 mM. Se indujo la hibridación con T2a introduciendo una solución que contiene ADN 20 !M, fosfato de sodio 25 mM (pH 7) , NaCl 25 mM y MgCl2 100 mM durante 30 minutos. Se calentó la solución de la diana hasta 40 ºC, se depositó sobre un electrodo invertido y se incubó durante 30 minutos. No se obtuvo ningún cambio en la señal cuando se introdujo un tampón o una secuencia no complementaria (T-NC) . Para la comparación, se muestran voltamogramas de una solución de Ru (NH3) 63+ 27 !M obtenida antes (línea de puntos) y... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección electroquímica de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende:

(a) proporcionar un dispositivo para detectar la presencia del ácido nucleico diana, comprendiendo dicho dispositivo un nanoelectrodo, en el que el nanoelectrodo comprende al menos un nanohilo metálico integrado dentro de una membrana de policarbonato y una sonda de ácido nucleico unida al nanohilo metálico; (b) poner en contacto la sonda de ácido nucleico con la muestra y una solución que comprende un compuesto de unión a ácido nucleico bajo una condición de hibridación; (c) generar una señal de la interacción electrostática entre la sonda de ácido nucleico y el compuesto de unión a ácido nucleico; (d) poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una solución que comprende una sonda activa redox; (e) amplificar la señal generada con la sonda activa redox; y (f) medir la señal amplificada, en el que un incremento de la señal amplificada detectada con relación a una señal amplificada de una muestra de control que no comprende ácido nucleico diana es indicativo de la presencia del ácido nucleico diana en la muestra.

2. Un procedimiento para la detección electroquímica de hibridación de ácido nucleico entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana en una muestra, que comprende: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre conjuntos de nanoelectrodos, en el que los conjuntos de nanoelectrodos comprenden un nanohilo metálico integrado dentro de un sustrato no conductor; (b) poner en contacto bajo condiciones de hibridación los conjuntos de nanoelectrodos y la sonda de ácido nucleico inmovilizada con la muestra, y un par redox que comprende un compuesto de unión a ácido nucleico que comprende un primer complejo de metal de transición y una sonda activa redox que comprende un segundo complejo de metal de transición, en el que la muestra y el par redox están en solución; y (c) medir una señal electrostática generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana en la muestra, en el que un incremento de la señal detectada con relación a una señal de una muestra de control que no comprende ácido nucleico diana, indica que se ha producido la hibridación de ácido nucleico.

3. Un procedimiento para la detección electroquímica de hibridación de ácido nucleico entre un primer nucleico y un segundo ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar el primer ácido nucleico inmovilizado sobre conjuntos de nanoelectrodos, en el que los conjuntos de nanoelectrodos comprenden un nanohilo metálico integrado dentro de un sustrato no conductor; (b) poner en contacto bajo condiciones de hibridación los conjuntos de nanoelectrodos y el primer ácido nucleico inmovilizado con una solución sospechosa de contener el segundo ácido nucleico, y que contiene un par redox que comprende un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y (c) medir una señal electrostática generada por hibridación del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, en el que un incremento de la señal detectada con relación a una señal de una muestra de control que no comprende segundo ácido nucleico, indica que se ha producido la hibridación de ácido nucleico.

4. Un procedimiento para la detección electroquímica de hibridación de ácido nucleico entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana en una muestra, que comprende: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre conjuntos de nanoelectrodos, en el que los conjuntos de nanoelectrodos comprenden un nanohilo metálico integrado dentro de un sustrato no conductor; (b) poner en contacto bajo condiciones de hibridación los conjuntos de nanoelectrodos y la sonda de ácido nucleico inmovilizada con la muestra, y un par redox que comprende un primer complejo de metal de transición y una sonda activa redox que comprende un ácido ascórbico o tripropilamina; en el que la muestra y el par redox están en solución; y (c) medir una señal electrostática generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana en la muestra, en el que un incremento de la señal detectada con relación a una señal de una muestra de control que no comprende ácido nucleico diana, indica que se ha producido la hibridación de ácido nucleico.

5. Un procedimiento para la detección electroquímica de hibridación de ácido nucleico entre un primer nucleico y un segundo ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar el primer ácido nucleico inmovilizado sobre conjuntos de nanoelectrodos, en el que los conjuntos de nanoelectrodos comprenden un nanohilo metálico integrado dentro de un sustrato no conductor; (b) poner en contacto bajo condiciones de hibridación los conjuntos de nanoelectrodos y el primer ácido nucleico inmovilizado con una solución sospechosa de contener el segundo ácido nucleico, y que contiene un par redox que comprende un primer complejo de metal de transición y una sonda activa redox que comprende un ácido ascórbico o tripropilamina; y (c) medir una señal electrostática generada por hibridación del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, en el que un incremento de la señal detectada con relación a una señal de una muestra de control que no comprende segundo ácido nucleico, indica que se ha producido la hibridación de ácido nucleico.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que la sonda de ácido nucleico comprende ADN.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que el ácido nucleico diana comprende ADN.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que el ácido nucleico diana comprende ARN.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que la sonda de ácido nucleico tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia del ácido nucleico diana.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 5, en el que el primer ácido nucleico comprende ADN.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 5, en el que el segundo ácido nucleico comprende 5 ADN.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 5, en el que el segundo ácido nucleico comprende ARN.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 5, en el que el primer ácido nucleico tiene una secuencia que es complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el nanohilo metálico comprende oro.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2-14, en el que el primer complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio, y en el que el segundo complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en hierro, cobalto, molibdeno, iridio, osmio y renio, y preferentemente en el que el primer complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2-14, en el que el primer complejo de metal de transición es un complejo de amonio de metal de transición, y en el que el segundo complejo de metal de transición es un complejo de cianato o cloruro de metal de transición, y preferentemente en el que el primer complejo de metal de transición es un complejo de amonio de metal de transición.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el nanohilo metálico comprende un nanohilo de oro.