CONTROL DE LA EXPRESIÓN DE GENES.

La presente invención se relaciona generalmente con un método para modificar la expresión de genes y con genes sintéticos para modificar la expresión endógena de genes en una célula, tejido u órgano eucariótico de un organismo transgénico, en particular de una planta o animal transgénico. Más particularmente, la presente invención utiliza tecnología de ADN recombinante para modificar o modular postranscripcionalmente la expresión de un gen objetivo en una célula, tejido, órgano u organismo completo eucariótico, por lo que se producen fenotipos novedosos. Los genes sintéticos novedosos y los constructos genéticos los cuales son capaces de reprimir, retardar o reducir de alguna otra manera la expresión de un gen endógeno o un gen objetivo en un organismo cuando se introduce en el mismo, también se proporciona. GENERALIDADES Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia en esta especificación se recolectan al final de la descripción Como se utiliza en la presente, el término "derivado de" se debe tomar para indicar que se puede obtener un entero especificado a partir de una fuente o especie especificada particular, aunque no necesariamente de manera directa de la fuente o especie especificada. A través de esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprende" o variaciones tales como "que comprende" o "comprendido" se entenderá que implica la inclusión de una etapa o elemento o entero o grupo de etapas o elementos o enteros establecidos, pero no la exclusión de ninguna etapa o elemento o entero o grupo de elementos o enteros. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita aquí es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Se debe entender que la invención incluye la totalidad de variaciones y modificaciones. La invención también incluye la totalidad de las etapas, rasgos, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o que se indican en esta especificación, individual o colectivamente, y cualquiera y la totalidad de las combinaciones o cualquiera de dos o más etapas o características. La presente invención no se limita en alcance por las realizaciones específicas descritas aquí, las cuales se pretenden para propósitos de ejemplificación únicamente. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la invención como se describe aquí. Los números de identidad de secuencia (SEC. DE IDENT. NOS) que contienen información de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos incluidos en esta especificación se recolectan después del extracto y se han preparado utilizando el programa Patentln Version 2.0. Cada nucleótido o secuencia de aminoácidos se identifica en la lista de secuencia por el indicador numérico <210> seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo <210>1, <210>2, etc.). La longitud, tipo de secuencia (ADN, proteína (PRT), etc.), y el organismo de fuente para cada secuencia nucleotídica o de aminoácidos se indica por la información que se proporciona en los campos de indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos a los que se hace referencia en la especificación se definen por la información que se proporciona en el campo de indicador numérico <400> seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo <400>1, <400>2, etc. La designación de residuos nucleotídicos a los que se hace referencia en la presente son los recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, en donde A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina, Y representa un residuo pirimidina, R representa un residuo purina, M representa adenina o citosina, K representa guanina o timina, S representa guanina o citosina, W representa adenina o timina, H representa un nucleótido diferente de guanina, B representa un nucleótido diferente de adenina; V representa un nucleótido diferente de timina, D representa un nucleótido diferente de citosina y N representa cualquier residuo nucleotídico. La designación de residuos aminoácidos a los que se hace referencia en la presente, recomendada por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, se incluyen en la tabla 1. 2   TABLA 1 Aminoácido Código de tres letras Código de una letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Ácido glutámico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptófano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Aspartato/asparagina Baa B Glutamato/Glutamina Zaa Z Cualquier aminoácido Xaa X ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El control de las vías metabólicas en organismos eucarióticos es deseable con el propósito de producir rasgos novedosos en los mismos o de introducir rasgos novedosos en células, tejidos u órganos particulares de tal organismo. Aunque la tecnología de ADN recombinante ha proporcionado un progreso significativo en al comprensión de los mecanismos que regulan la expresión de genes eucarióticos, se ha hecho un progreso mucho menor en la manipulación real de la expresión de genes para producir rasgos novedosos. Además, existen únicamente medios limitados mediante los cuales la invención humana puede llevar a una modulación del nivel de la expresión del gen eucariótico. Una solución para reprimir, retardar o reducir de alguna otra manera la expresión de genes utiliza una molécula de ARNm la cual se transcribe de la cadena complementaria de un gen nuclear a aquel el cual normalmente se transcribe capaz de ser traducido en un polipéptido. Aunque el mecanismo preciso involucrado en este enfoque no se ha establecido, se ha postulado que el ARNm de cadena doble puede formar el pareamiento de bases entre secuencias nucleotídicas complementarias, para producir un complejo el cual se traduce con baja eficiencia y/o se degrada por enzimas de ribonucleasa intracelulares antes de ser traducido. 3   Alternativamente, la expresión de un gen endógeno en una célula, tejido u órgano se puede suprimir cuando una o más copias de tal gen, o una o más copias de un gen sustancialmente similar se introducen en la célula. Aunque el mecanismo involucrado en este fenómeno no se ha establecido y parece involucrar procesos mecanísticamente heterogéneos. Por ejemplo, este enfoque se ha postulado que involucra represión transcripcional, en cuyo caso se forman estados reprimidos somática-heredablemente de cromatina, o bien alternativamente, un silenciador transcripcional en donde normalmente se produce el inicio de la transcripción, pero los productos de ARN en los genes cosuprimidos posteriormente se eliminan. La eficiencia de ambos enfoques en el direccionamiento de la expresión de genes específicos es muy baja y habitualmente se obtienen resultados altamente variables. Los resultados inconsistentes se obtienen utilizando regiones diferentes de los genes, por ejemplo regiones 5' no traducidas, regiones 3' no traducidas, regiones codificantes o secuencias de intrón para la expresión del gen objetivo. En consecuencia, actualmente no existe consenso respecto a la naturaleza de las secuencias genéticas las cuales proporcionan el medio más eficiente para reprimir, retardar o reducir de alguna otra manera la expresión de genes utilizando las tecnologías existentes. Además, tal grado elevado de variación existe entre generaciones de manera que no es posible predecir el nivel de represión de un gen específico en la progenie de un organismo en el cual la expresión del gen es modificada marcadamente. Recientemente, Dorer y Henikoff (1994) demostraron el silenciado de copias de genes repetidas en batería en el genoma de Drosophila y la represión transcripcional de genes Adh de Drosophila dispersado por genes Polycomb (es decir, el sistema Pc-G; Pal-Bhadra et al., 1997). Sin embargo, tal silenciado de copias de genes repetidas en batería es de poca utilidad en un intento por manipular la expresión de genes en una célula animal por medios recombinantes, en donde las secuencias capaces de dirigir la expresión de un gen particular se introducen en posiciones dispersadas en el genoma, ausentes de la combinación de este enfoque con la tecnología de direccionamiento de genes. Aunque teóricamente es posible, tales combinaciones se espera que trabajen únicamente a baja eficiencia, en base en la baja eficiencia de las soluciones de direccionamiento de genes utilizadas en el aislamiento y además, esto puede requerir complicados sistemas de vectores. Además, la utilización de represión transcripcional, tal como en el sistema Pc-G de Drosophila, puede parecer que requiera cierto conocimiento de los mecanismos... [Seguir leyendo]

1. Gen sintético que permite reprimir, retardar o reducir la expresión de un gen objetivo en una célula eucariótica, caracterizado porque el gen sintético comprende una molécula de ácido nucleico extraño que comprende múltiples copias de una secuencia (a) que comprende 100 nucleótidos, la cual es sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos del gen objetivo, en donde las múltiples copias se presentan como una secuencia palindrómica interrumpida, y el ácido nucleico extraño está operablemente bajo el control de una única secuencia promotora. 2. El gen sintético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el gen objetivo es endógeno al genoma de la célula. 3. El gen sintético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el gen objetivo es no-endógeno al genoma de la célula. 4. El gen sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende además un terminador operable en dicha célula eucariótica. 5. El gen sintético de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho terminador es activo en una célula vegetal. 6. Composición, caracterizada porque comprende el gen sintético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en asociación con un portador, excipiente o diluyente. 7. Célula eucariótica aislada, caracterizada porque comprende un gen sintético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 8. Organismo transgénico no humano, caracterizado porque comprende un gen sintético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 9. Uso de un gen sintético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para reprimir, retardar o reducir la expresión de un gen objetivo en una célula eucariótica aislada. 10. Gen sintético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para el uso en terapia. 11. Método para reprimir, retardar o reducir la expresión de un gen objetivo en una célula eucariótica, caracterizado porque comprende: i) seleccionar una molécula de ácido nucleico extraño que comprende múltiples copias de una secuencia de nucleótidos (a) que comprende 100 nucleótidos, la cual es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo o de una región de éste, en donde las múltiples copias se presentan como una secuencia palindrómica interrumpida, ii) producir un gen sintético que comprende la molécula de ácido nucleico extraño operable bajo el control de una única secuencia promotora, iii) introducir el gen sintético en dicha célula, iv) expresar el gen sintético en dicha célula, en donde la represión, retardo o reducción de la expresión del gen objetivo no se lleva a cabo solamente por la represión o reducción de la transcripción del gen objetivo y en donde dicho método no es un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia, ni un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. 12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el gen objetivo es endógeno a la célula. 13. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el gen objetivo es no-endógeno a la célula. 14. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque la traducción del producto de la transcripción del ARNm del gen objetivo es reducida o retardada. 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el transcripto de ARNm del gen objetivo es degradado de manera específica de secuencia por un sistema de célula huésped endógena.   FIGURA 1 36   FIGURA 2 37   FIGURA 3 38   FIGURA 4 39   Ampicilina FIGURA 5 Canamicina   FIGURA 6 41   FIGURA 7 42   Ampicilina FIGURA 8 43 Canamicina   Ampicilina FIGURA 9 Canamicina 44   Ampicilina FIGURA 10 Canamicina   Ampicilina FIGURA 11 46 Canamicina   FIGURA 12 47   FIGURA 13 48   FIGURA 14 49   FIGURA 15   FIGURA 16 51   FIGURA 17 52   FIGURA 18 53   FIGURA 19 54   FIGURA 20   FIGURA 21 56   FIGURA 22 57   FIGURA 23 58   FIGURA 24 59   FIGURA 25   FIGURA 26 61   FIGURA 27 62   FIGURA 28 63   FIGURA 29 64   FIGURA 30   FIGURA 31 66   FIGURA 32 67   FIGURA 33 68   FIGURA 34 69   FIGURA 35   FIGURA 36 71   FIGURA 37 72   FIGURA 38 73   FIGURA 39 74   FIGURA 40   FIGURA 41 76   FIGURA 42 77 Ampicilina   FIGURA 43 78 Ampicilina   FIGURA 44 79   FIGURA 45   FIGURA 46 81   FIGURA 47 82   FIGURA 48 83   FIGURA 49 84   FIGURA 50   FIGURA 51 86   FIGURA 52 87   FIGURA 53 88   FIGURA 54 89   FIGURA 55 Ampicilina   FIGURA 56 91 Ampicilina   FIGURA 57 92 Ampicilina   FIGURA 58 93 Ampicilina   FIGURA 59 94 Ampicilina   FIGURA 60 Ampicilina   FIGURA 61 96 Ampicilina   FIGURA 62 97 Ampicilina   FIGURA 63 98 Ampicilina   FIGURA 64 99 Ampicilina   FIGURA 65 Ampicilina   FIGURA 66 101 Ampicilina   FIGURA 67 102 Ampicilina   FIGURA 68 103 Ampicilina