Un método para producir un tumor, cuya tumorogenicidad depende de un genoma no recombinante,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una célula de ratón condicionalmente tumorogénica que comprende

(i) una o más mutaciones tales que ambos alelos de un gen supresor de tumores endógeno estén ausentes o no funcionales, y

(ii) un oncogén recombinante unido operativamente con un promotor inducible, en el que

(ii.1) la tumorogenicidad de la célula de ratón condicionalmente tumorogénica depende de la expresión del oncogén recombinante inducible y

(ii.2) el promotor inducible está en el estado no inducido;

(b) introducir en la célula un gen humano recombinante de interés que complemente funcionalmente al oncogén recombinante, restaurando de este modo la tumorogenicidad sin expresión del oncogén recombinante inducible.

(c) colocar la célula de la etapa (b) en un ratón receptor;

(d) mantener el ratón receptor y observar el ratón con respecto a desarrollo tumoral; y

(e) recoger el tumor, cuya tumorogenicidad depende del gen humano recombinante.

Complementación dirigida

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de Estados Unidos Nº de Serie 11/099.735, presentada el 5 de abril de 2005 y Nº de Serie 11/282.847, presentada el 17 de noviembre de 2005.

Campo de la invención

El campo de la invención es la biología molecular, oncología y desarrollo de fármacos.

Antecedentes de la invención

Los modelos de cáncer de ratón en los que los tumores primarios están dirigidos por oncogenes obtenidos por ingeniería genética de forma específica han sido herramientas crecientemente útiles en investigación de cáncer en años recientes. Aunque requieren marcos temporales relativamente largos para cruces genéticos y latencia de tumores espontáneos, los métodos actuales para producir tales ratones modificados por ingeniería genética generalmente han sido adecuados para producir números relativamente pequeños de genotipos para investigación básica.

Se describe un modelo de cáncer de mama inducible en el documento WO2004/089073.

El documento WO 2002/079419 describe un método para identificar un gen relacionado con cáncer. El método incluye (a) proporcionar células en las que la tumorogenicidad depende de la expresión de un oncogén; (b) mantener las células en condiciones en las que las células no expresan el oncogén, siendo las células tumorogénicas cuando se expresa el oncogén; (c) introducir en las células una molécula de ácido nucleico que se integre en el genoma de las células, marcando de este modo los loci en los que se integra la molécula de ácido nucleico; (d) identificar una célula en la que se ha inducido tumorogenicidad por integración de la molécula de ácido nucleico; y (e) identificar, como el gen relacionado con cáncer, un gen que se ha marcado en la célula de (d) por la molécula de ácido nucleico integrada.

John D. Allen y Anton Berns han descrito complementación de un oncogén inactivado para producir un tumor de tipo similar como una manera de explorar la ruta bioquímica en la que actúa el oncogén (Allen JD et al, Seminars in Cancer Biology, vol. 7, 1996, páginas 299-306) .

Los tumores primarios de modelos de ratón serían particularmente útiles en estudios de desarrollo de fármacos, así como en investigación básica. Esto se debe a que fenotipos tumorales similares o indistinguibles, por ejemplo, carcinoma de mama, pueden experimentar transformación neoplásica a través de la adquisición espontánea de diferentes mutaciones, que conduce a diferentes genotipos de células tumorales. Debido a los diferentes fenotipos de diferentes tumores, un fármaco dado puede ser eficaz contra un tumor pero no contra el otro tumor del mismo fenotipo. En consecuencia, experimentos de xenotrasplantes convencionales que usan una línea celular de cáncer humano establecida probablemente proporcionan una imagen incompleta. Por la misma razón, los datos de ensayos clínicos simplemente indicarán que el fármaco es eficaz en algunos pacientes pero no en otros.

A pesar de la conveniencia de material de tumor primario genéticamente definido para estudios de desarrollo de fármacos, el tiempo y los recursos que se requerirían para generar los modelos de ratón necesarios han hecho poco práctico diseñar estudios de desarrollo de fármacos preclínicos en torno al uso de material tumoral primario en el que la tumorogenicidad depende de un gen preseleccionado de interés, es decir, gen diana.

Descripción resumida de la invención

La invención proporciona un método para producir una célula de ratón tumorogénica, la tumorogenicidad de la cual depende de un gen recombinante de interés, que comprende las etapas de proporcionar una célula de ratón condicionalmente tumorogénica que comprende una o más mutaciones de modo que ambos alelos de un gen supresor de tumores endógeno esté ausente o sea no funcional, y un oncogén recombinante unido operativamente a un promotor inducible, en el que la expresión del oncogén recombinante es necesaria y suficiente para tumorogenicidad de la célula de ratón condicionalmente tumorogénica, y el promotor inducible está en el estado no inducido; e introducir en la célula un gen recombinante de interés que complementa funcionalmente al oncogén, restaurando de este modo la tumorogenicidad sin expresión del oncogén recombinante inducible.

Son ejemplos de genes supresores de tumores que pueden suprimirse de forma útil Rb, P53, INK4a, PTEN, LATS, Apafl, Caspasa 8, APC, DPC4, KLF6, GSTP1, ELAC2/HPC2, NKX3.1, ATM, CHK2, ATR, BRCA1, BRCA2, MSH2, MSH6, PMS2, Ku70, Ku80, DNA/PK, XRCC4, Neurofibromatosis de Tipo 1, Neurofibromatosis de Tipo 2, Poliposis Adenomatosa del Colon, la proteína supresora de tumores de Wilms, Patched y FHIT. Son genes supresores de tumores preferentemente suprimidos INK4a, P53, PTEN y Rb. Se prefiere particularmente supresión de INK4a.

Los ejemplos de oncogenes recombinantes útiles en la presente invención incluyen Her2, KRAS, HRAS, NRAS, EGFR, MDM2, TGF-º, RhoC, AKT, c-myc, º-catenina, PDGF, C-MET, PI3K-110a, CDK4, ciclina B1, ciclina D1, gen receptor de estrógenos, gen receptor de progesterona, ErbB1, ErbB3, PLK3, KIRREL, ErbB4, TGFa, ras-GAP, Shc, Nck, Src, Yes, Fyn, Wnt Bcl2, antígeno PyV MT y antígeno SV40 T. Son oncogenes preferidos Her2, KRAS C-MET, PI3K-CA y AKT. Se prefieren particularmente Her2 y KRas.

Los ejemplos de sistemas promotores inducibles adecuados para controlar la expresión del oncogén recombinante incluyen un sistema regulador del promotor dependiente de tetraciclina, un sistema promotor de metalotionina, un sistema promotor de IPTG/lacI, un sistema promotor de ecdisona, y un sistema Gal4/UAS.

También se describe en la presente memoria un método para ensayar un compuesto con respecto a efectos antitumorales. El método incluye las etapas de: (a) producir, como se ha descrito anteriormente, una multiplicidad de células de ratón tumorogénicas, la tumorogenicidad de las cuales depende de la expresión de un gen recombinante de interés; (b) implantar las células en una multiplicidad de ratones hospedadores; (c) obtener tumores en los ratones derivados de las células implantadas; (d) administrar cantidades adecuadas de un compuesto de ensayo a los ratones; y (e) determinar efectos antitumorales, si los hubiera, del compuesto de ensayo.

Como se usa en la presente memoria, “knockout de supresor de tumores” significa una o más mutaciones tales que ambos alelos de un gen supresor de tumores endógeno están ausentes o no son funcionales.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la invención. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones, prevalecerá.

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 es un dibujo esquemático que ilustra el concepto básico de complementación dirigida.

La FIGURA 2 es un dibujo esquemático que ilustra la propagación in vivo y “amplificación” de material tumoral para su uso en estudios de respuesta a fármacos.

La FIGURA 3 es un dibujo esquemático que ilustra un diseño experimental básico para un ensayo de respuesta a fármacos.

La FIGURA 4 es un histograma que ilustra los niveles de ARNm de MET humano (hMET) y HGF humano (hHGF) en tumores Complementados Directos de MET/HGF (DC) . Se ilustran los niveles de PCR en tiempo real (RT-PCR) para ARN de referencia de control humano y de ratón (hRef y Mref) y 14 tumores MET/HGF DC generados de forma independiente. Las flechas indican tumores DC hMEG/hHGF seleccionado para estudios de propagación posteriores.

La FIGURA 5 es un histograma que ilustra los niveles de ARNm de hMET en tumores MET/HGF-DC y propagación posterior. El análisis de RT-PCR se realizó en tres tumores complementados directos de MET/HGF generados de forma independiente y sus muestras propagadas. Se usó ARN de referencia universal humano (hr) como un control positivo y ARN de tumor CON DOXY (on dox) y de referencia universal de ARN de ratón (mr) se usaron como controles negativos.

La FIGURA 6 es un histograma que ilustra los niveles de ARNm de hHGF en tumores MET/HGF-DC y propagación posterior. El análisis de RT-PCR... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un tumor, cuya tumorogenicidad depende de un genoma no recombinante, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una célula de ratón condicionalmente tumorogénica que comprende

(i) una o más mutaciones tales que ambos alelos de un gen supresor de tumores endógeno estén ausentes o no funcionales, y

(ii) un oncogén recombinante unido operativamente con un promotor inducible, en el que

(ii.1) la tumorogenicidad de la célula de ratón condicionalmente tumorogénica depende de la expresión del oncogén recombinante inducible y

(ii.2) el promotor inducible está en el estado no inducido;

(b) introducir en la célula un gen humano recombinante de interés que complemente funcionalmente al oncogén recombinante, restaurando de este modo la tumorogenicidad sin expresión del oncogén recombinante inducible.

(c) colocar la célula de la etapa (b) en un ratón receptor;

(d) mantener el ratón receptor y observar el ratón con respecto a desarrollo tumoral; y

(e) recoger el tumor, cuya tumorogenicidad depende del gen humano recombinante.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el gen se selecciona del grupo que consiste en AKT1 humana, EGFR activada humana (EGFR*) , mTOR humana, y tanto cMET como HGF humana

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el gen supresor de tumores se selecciona del grupo que consiste en Rb, P53, INK4a, PTEN, LATS, Apafl, Caspasa 8, APC, DPC4, KLF6, GSTP1, ELAC2/HPC2, NKX3.1, ATM, CHK2, ATR, BRCA1, BRCA2, MSH2, MSH6, PMS2, Ku70, Ku80, DNA/PK, XRCC4, Neurofibromatosis de Tipo 1, Neurofibromatosis de Tipo 2, Poliposis Adenomatosa del Colon, la proteína supresora de tumores de Wilms, Patched y FHIT.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen supresor de tumores se selecciona del grupo que consiste en INK4a, P53, PTEN y Rb.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el gen supresor de tumores es INK4a.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el oncogén recombinante inducible se selecciona del grupo que consiste en Her2, KRAS, HRAS, NRAS, EGFR, MDM2, TGF-, RhoC, AKT, c-myc, -catenina, PDGF, C-MET, PI3K-110a, CDK4, ciclina B1, ciclina D1, gen del receptor de estrógenos alfa, gen del receptor de progesterona, ErbB1, ErbB3, PLK3, KIRREL, ErbB4, TGFa, ras-GAP, Shc, Nck, Src, Yes, Fyn, Wnt Bcl2, antígeno PyV MT y antígeno SV40 T.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el oncogén recombinante inducible se selecciona del grupo que consiste en Her2, KRAS, C-MET, PI3K-CA y AKT.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el oncogén recombinante inducible es Her2 o KRas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el sistema promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en un sistema regulador promotor dependiente de tetraciclina, un sistema promotor de metalotionina, un sistema promotor de IPTG/lacl, un sistema promotor de ecdisona y un sistema Gal4/UAS.