Clústeres de genes biosintéticos lantibióticos a partir de A. garbadinensis y A. liguriae.

Compuesto de fórmula: **Fórmula**

donde:

-X1-X2- representan -Leu-Val-;

-Y- es -S-;

Z es o bien un aminoácido o -NH2 donde el último representa la N-terminal de Ala en la posición 1;

R representa -OH o-NR1R2, donde R1 y R2 independientemente representa:

(i) hidrógeno;

(ii) un grupo de fórmula - (CH2) n-NR3R4, en la que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4, o R3 y R4 conjuntamente representan un grupo - (CH2) 3-,

- (CH2) 4-,

(CH2) 2-O- (CH2) 2-,

- (CH2) 2-S- (CH2) 2 o

- (CH2) -;

o R1 y R2 conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan una mitad de piperazina que puede estar substituida en la posición 4 con un substituyente seleccionado a partir de:

(a) alquilo C1-4;

(b) cicloalquilo C5-7;

(c) piridil,

(d) - (CH2) p-NR5R6 en el que p representa un entero de 1 a 8 y R5 y R6 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4;

(e) piperidinil;

(f) piperidinil substituido, donde el piperindinil substituido lleva un substituyente N que es alquilo C1-4;

(g) bencil;

y (h) bencil substituido, donde el grupo fenil lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Clústeres de genes biosintéticos lantibióticos a partir de A. Garbadinensis y A. Liguriae Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a la caracterización del clúster del gen biosintético para la actagardina como lantibiótico, a la identificación de una nueva variante de la actagardina y a sus clústeres biosintéticos y a los procedimientos para su preparación y a la utilización de la actagardina, a una nueva variante de la actagardina producida en una cepa de A. liguriae, y a variantes de ambos de estos obtenidas según la presente invención, utilizando genes a partir de clústeres de genes biosintéticos caracterizados.

Antecedentes de la invención [0002] Los lantibióticos son péptidos que tienen actividad antibiótica y otras, producidos por bacterias Grampositivas. Estos contienen entre otros residuos modificados, los aminoácidos lantionina y metillantionina de tioéter, que entrecruzan la cadena del péptido en una estructura policíclica. Están clasificados en dos clases, tipo-A y tipo-B, aunque dicha clasificación no es problemática. Generalmente, los lantibióticos de tipo-A son anfifílicos alargados que son capaces de formar poros en la membrana bacteriana u otras membranas plasmáticas. Ejemplos son nisin and subtilin. Los lantibióticos de tipo-B, por contra, son globulares, péptidos definidos conformacionalmente que inhiben las funciones enzimáticas. Ejemplos son cinnamicina y duramicina.

Las actividades atribuidas a los lantibióticos tipo-B tales como cinnamicina incluyen actividades antimicrobianas (proporcionando aplicación potencial como antibióticos) , inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina (proporcionando una aplicación potencial en la regulación de la presión sanguínea) , inmunomodulación vía inhibición de la fosfolipasa A2 (proporcionando una aplicación potencial con anti-inflamatorios) , e interferencia con la biosíntesis de la prostaglandina y la leucotriena.

Los lantibióticos de tipo-B parecen ejercer su actividad mediante la interferencia con las actividades enzimáticas mediante el bloqueo de las substancias respectivas. Por ejemplo, se ha encontrado que los lantibióticos de tipo-B, tales como la mersacidina y la actagardina, inhiben la biosíntesis del peptidoglican; la transglicosilación se identificó como la reacción diana. El sustrato para esta reacción es la pared celular del enlace lipídico del precursor lípido II. Aunque ests es una diana para el lantibiótico vancomicina, el sitio de acción es diferente y es un nuevo sitio de unión a diana no utilizado por ningún fármaco antibacteriano actual.

Para la clase cinnamicina de lantibióticos de tipo B se ha observado actividad antibacteriana, en particular con cepas de Bacillus, con efectos descritos en las funciones de membrana, translocación de protones dependientes de ATP y aceptación Ca2+ y en ATPasas. También, se ha descrito la formación de poros definidos en membranas planares que contienen fosfatidiletanolamina. Estos efectos pueden atribuirse a la unión específica de estos lantibióticos de tipo B para la fosfatidiletanolamina.

Los lantibióticos han mostrado tener eficacia y utilidad como aditivos alimentarios y agentes antibacterianos contra acnés propionibacterios y patógenos problemáticos, por ejemplo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) , que es o está desarrollando resistencia a muchos antibióticos habitualmente utilizados, y Streptococcus pneumoniae. Para revisar, véase Sahl y Bierbaum (1998) Rev. Anual Microbiol. 52:41-79; Jack y Sahl (1995) TIBTECH 13:269 278; Gasson (1995) Capítulo 10, Lantibióticos, en Vining y Stuttard (eds) Series de Biotecnología: Genética y Bioquímica de Fabricación de Antibióticos, Biotechnological I 30 Serie 28, páginas 283-306.

En el campo de los antibióticos existe una continua necesidad de proporcionar nuevos compuestos antibióticos para superar cuestiones tales como la resistencia, bio-compatibilidad, toxicidad y semejantes. En consecuencia, es deseable encontrar procedimientos para la preparación de lantibióticos y la fabricación de formas variantes de lantibióticos (que puedan tener un perfil de actividad diferente comparado con las formas naturales) .

La actagardina es un lantibiótico tetracíclico conocido de tipo B de 19 aminoácidos de longitud (1890 Da) . Tiene potente actividad contra patógenos Gram positivos importantes tales como Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes ambos en modelos de animal in vitro e in vivo. La estructura de la actagardina se muestra en la Figura 4. El compuesto se obtiene a partir de un prepro-péptido, la parte C-terminal del cual tiene la secuencia polipeptídica SSGWVCTLTIECGTVICAC (SEQ ID NO: 4) . El polipéptido de SEQ ID NO:4 se modifica mediante las siguientes reticulaciones, creando la estructura secundaria y terciaria: RETICULACIÓN 1-6, Lantionina (Ser-Cys) ; RETICULACIÓN 7-12, Beta-metillantionina (Thr-Cys) ; RETICULACIÓN 9-17, Betametillantionina (Thr-Cys) ; RETICULACIÓN 14-19, Beta-metillantionina sulfóxido (Thr-Cys) .

Se ha descrito que la actagardina se produce por dos especies de Actinoplanes; A. garbadinensis y A. liguriae. También se coproduce un análogo en el cual la RETICULACIÓN 14-19 no está oxidada, es decir, es un sulfóxido de betametillantionina no beta-metillantionina que se denomina aquí desoxi-actagardina.

La patente americana US 6.022.851 describe el aislamiento de la actagardina a partir de las cepas aisladas de A. garbadinensis y A. liguriae.

Descripción de la Invención [0011] La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula:

donde: -X1-X2- representan -Leu-Val-; -Y- es -S-; Z es o bien un aminoácido o -NH2 donde el último representa la N-terminal de la Ala en la posición 1; R representa -OH o -NR1R2, donde R1 y R2 independientemente representan:

(i) hidrógeno;

(ii) un grupo de formula - (CH2) nNR3R4, en el que n representa un número entero de 2 a 8 y R3 y R4 representan independientemente hidrógeno o un alquilo C1-4, o R3 y R4 tomados conjuntamente representa un grupo - (CH2) 3-, (CH2) 4-, (CH2) 2-O- (CH2) 2-, - (CH2) 2-S- (CH2) 2 o - (CH2) 5-; o R1 y R2 tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan un grupo piperacina que puede estar substituido en la posición 4 con un substituyente seleccionado entre:

(a) alquilo C1-4;

(b) cicloalquilo C5-7;

(c) piridilo,

(d) - (CH2) p-NR5R6 en el que p representa un número entero de 1 a 8 y R5 y R6 representan independientemente hidrógeno o alquilo C1-4;

(e) piperidinil;

(f) piperidinil substituido, donde el piperidinil substituido lleva un substituyente-N que es alquilo C1-4;

(g) bencilo; y

(h) bencilo substituido, donde la mitad fenilo lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto, la invención se refiere a la información normativa estructurada, aclarada, secuenciada y clonada pertinente para el clúster de genes biosintéticos para el lantibiótico de tipo B, actagardina, a partir de Actinoplanes garbadinensis y A. liguriae.

También sorprendentemente se ha encontrado que en un aislamiento de A. liguriae, designado aquí como A. liguriae NCIMB 41362, se ha producido una nueva forma de actagardina que los presentes inventores han calificado actagardina B o, en la forma no oxidada, desoxiactagardina B. Estas formas tienen actividad antimicrobiana parecida para la actagardina y están generadas a partir de la secuencia polipeptídica primaria de SEQ ID NO:1, que experimenta reticulación parecida a la actagardina. Las variantes proporcionan nuevas y útiles alternativas a la actagardina. Además, la identificación de los residuos en actagardina B que son diferentes de la actagardina conducen a la fabricación de otros lantibióticos basados en estas diferencias.

Los inventores también han aislado clústeres de genes aislados a partir de actagardina que produce A. garbadinensis y A. liguriae NCIMB 41362 que comprende los genes para la fabricación de actagardina y actagardina B.

En un aspecto, la presente invención proporciona la nueva actagardina B y variantes de la misma, que incluyen variantes basadas en las secuencias polipeptídicas primarias de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, así como las variantes de las mismas.

En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para la actagardina B y sus variantes, juegos de ácidos nucleicos y variantes de los mismos derivados de los clústeres... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula:

donde: -X1-X2- representan -Leu-Val-; -Y- es -S-; Z es o bien un aminoácido o -NH2 donde el último representa la N-terminal de Ala en la posición 1; R representa -OH o-NR1R2, donde R1 y R2 independientemente representa:

(i) hidrógeno;

(ii) un grupo de fórmula - (CH2) n-NR3R4, en la que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4, o R3 y R4 conjuntamente representan un grupo - (CH2) 3-, - (CH2) 4-, (CH2) 2-O- (CH2) 2-, - (CH2) 2-S- (CH2) 2 o - (CH2) 5-; o R1 y R2 conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan una mitad de piperazina que puede estar substituida en la posición 4 con un substituyente seleccionado a partir de:

(a) alquilo C1-4;

(b) cicloalquilo C5-7;

(c) piridil,

(d) - (CH2) p-NR5R6 en el que p representa un entero de 1 a 8 y R5 y R6 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4;

(e) piperidinil;

(f) piperidinil substituido, donde el piperindinil substituido lleva un substituyente N que es alquilo C1-4;

(g) bencil; y

(h) bencil substituido, donde el grupo fenil lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde Z es un aminoácido.

3. Compuesto según la reivindicación 2, donde el aminoácido es Ala.

4. Compuesto según la reivindicación 1, donde Z es -NH2.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R es OH.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R1 y R2 independientemente representan:

(i) hidrógeno;

(ii) un grupo de fórmula - (CH2) n-NR3R4, en el que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4.

7. Compuesto según la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en: desoxiactagardina B N-[3-dimetilaminopropil]monocarboxamida; desoxiactagardina B N-[1- (1-metil-4-piperidinil) piperazina]monocarboxamida; desoxiactagardina B [1- (3-dimetilaminopropil) piperazina]monocarboxamida; desoxiactagardina B; D-Ala (0) desoxiactagardina B; L-Ile (0) desoxiactagardina B; L-Val (0) desoxiactagardina B; L-Phe (0) desoxiactagardina B; L-Lys (0) desoxiactagardina B; y L-Trp (0) desoxiactagardina B.

8. Composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, para la administración oral.

10. Compuesto según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para utilizar en un método de tratamiento.

11. Compuesto según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para utilizar en un método de 10 tratamiento de una infección bacteriana.

12. Utilización de un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para la utilización en el tratamiento de una infección bacteriana.

13. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula:

donde: -X1-X2- representa -Leu-Val-;

-Y- es -S-; Z es Ala o -NH2 donde el último representa la N-terminal de Ala en la posición 1, comprendiendo el método la expresión de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11, y opcionalmente cuando sea necesario, genes clúster asociados requeridos para la conversión del polipéptido precursor al producto.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, donde el ácido nucleico se expresa en A. liguriae.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, donde la A. liguriae se deposita bajo el Tratado de Budapest con el número de depósito: NCIMB41362.