Citocromo P450 monooxigenasas de bacterias termófilas.

Citocromo P450 monooxigenasa, caracterizada porque ella exhibe una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:

2, así como equivalentes funcionales de ella los cuales se diferencian de SEQ ID NO:2 por 1 a 30 adiciones, sustituciones, borrados y/o inversiones de aminoácidos y donde la modificación de la secuencia, determinada mediante el empleo del sustrato de referencia ß-ionona, no cambia la actividad de la monooxigenasa en más de ± 90%, donde la actividad es determinada bajo condiciones estandarizadas, es decir 0,1 a 0,5 M del sustrato, pH = 6 a 8 y T = 60 -70°C.

Citocromo p450 monooxigenasas de bacterias termófilas La invención se refiere a nuevas citocromo P450 monooxigenasas de bacterias termófilas, en particular del género Thermus sp., a las secuencias de nucleótidos que codifican para ello, la producción recombinante de estas monooxigenasas y su aplicación para la oxidación microbiológica de compuestos orgánicos.

Las citocromo P450 monooxigenasas poseen la capacidad de catalizar reacciones de oxigenación comercialmente interesantes y por ello son investigadas intensamente desde hace algún tiempo. De este modo se aisló y caracterizó por ejemplo la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium y está disponible actualmente por la vía recombinante (ver por ejemplo DE-A-199 35 115) .

Esta citocromo P450-monooxigenasa cataliza usualmente la hidroxilación subterminal de ácidos saturados de cadena larga y las correspondientes amidas y alcoholes de ellos o la epoxidación de ácidos grasos insaturados de cadena larga o ácidos grasos saturados con longitud media de cadena. La longitud óptima de cadena de ácidos grasos saturados es de 14 a 16 átomos de carbono.

La estructura del dominio hem de P450 BM-3 fue determinada mediante análisis estructural de rayos X. Los sitios de unión al sustrato están presentes en forma de una abertura larga de tipo túnel, el cual alcanza desde la superficie de la molécula justamente hasta la molécula hem y está limitado casi exclusivamente por radicales hidrófobos de aminoácido. Los únicos radicales cargados sobre la superficie del dominio hem son los radicales Arg47 y Tyr51. Se supone que estos participan en la unión de los grupos carboxilato del sustrato mediante la formación de un enlace de puente hidrógeno. Esta introducción focalizada de mutaciones puntuales es medianamente exitosa en la ampliación del espectro de sustrato de esta enzima. Así, mediante esta enzima pueden oxidarse actualmente también ácidos carboxílicos, alcanos, alquenos tanto de cadena corta como de cadena larga, cicloalcanos, cicloalquenos y diferentes compuestos aromáticos (ver DE-A-199 35 115, 199 55 605, 100 11 723 y 100 14 085) .

De allí que para mejorar más la aplicabilidad industrial de este tipo de enzimas era deseable encontrar nuevas citocromo P450-monooxigenasas, las cuales se ajustaran mejor a las condiciones de producción industrial, como por ejemplo enzimas con elevada estabilidad térmica.

De allí que fue objetivo de la presente invención poner a disposición citocromo P450-monooxigenasas, que se ajustaran mejor a las condiciones de producción industrial.

El objetivo de arriba fue logrado poniendo a disposición una citocromo P450 monooxigenasa según la reivindicación 1. Ella puede incluir en particular una secuencia parcial de radicales aminoácido Pro328 a Glu345 según SEQ ID NO:2 y preferiblemente además una secuencia parcial de radicales aminoácido Val216 a Ala227 según SEQ ID NO:2.

Se manifiestan citocromo P450 monooxigenasas que exhiben una secuencia de aminoácidos, la cual incluye al menos otra secuencia parcial que es elegida de entre una secuencia parcial de al menos 10 aminoácidos consecutivos de los rangos de secuencia especificados por los radicales aminoácido Met1 a Phe327 y Gly346 a Ala389 según SEQ ID NO:2.

Una citocromo P450 monooxigenasa particularmente preferida posee una secuencia de aminoácidos que corresponde esencialmente a SEQ ID NO: 2.

Las citocromo P450 monooxigenasas acordes con la invención pueden ser aisladas en particular de bacterias termófilas, preferiblemente del género Thermus sp., como por ejemplo de la especie Thermus thermophilus, cepa HB27 (depositada por DSM bajo el número DSM7039) . Las bacterias "termófilas" satisfacen de acuerdo con la invención los criterios de tolerancia a la temperatura según H.G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, editorial Thieme Stuttgart, 5ª edición, página 173, para organismos termófilos y termófilos extremos (es decir crecimiento óptimo por encima de 40 °C) .

Las monooxigenasas acordes con la invención se caracterizan preferiblemente con una elevada estabilidad a latemperatura. Ésa se expresa en una baja pérdida de actividad a elevada temperatura (por ejemplo el rango de 30 a 60 °C, pH 7, 5, 25mM Tris/HCl) en comparación con la de P450 BM-3 de Bacillus megaterium.

Según una forma preferida de operar, se pone a disposición una citocromo P450 monooxigenasa acorde con la invención de la bacteria termófila T. thermophilus. La proteína posee un peso molecular de aproximadamente 44 kDa (determinado mediante electroforesis en gel SDS) , es soluble y muestra en el estado reducido, estado oxidado y como producto de adición carbonílica un espectro de absorción análogo al de otras enzimas P450. A partir de

comparaciones de secuencia de esta enzima acorde con la invención de T. thermophilus y otras enzimas P450 conocidas pudieron determinarse las siguientes identidades: P450 BM3, 32% de identidad; CYP119, 29% de identidad; P450er y F, 31% de identidad. La enzima acorde con la invención muestra una extraordinaria estabilidad térmica, ilustrada por una temperatura de fusión de aproximadamente 85°C, cuyo valor está 30°C por enc ima de la de P450cam.

Se manifiestan además oligonucleótidos, que hibridan con una secuencia de ácidos nucleicos, que codifican para una citocromo P450 monooxigenasa acorde con la invención.

En particular se manifiestan también tales oligonucleótidos, que incluyen una secuencia de ácidos nucleicos que es esencialmente complementaria a un rango de secuencia de nucleótido que incluye al menos 30 a 45 radicales nucleótido consecutivos, según SEQ ID NO:1.

Se manifiestan polinucleótidos que hibridan con un oligonucleótido según la definición de arriba y codifica para una citocromo P450 monooxigenasa, en particular una citocromo P450 monooxigenasa de otros microorganismos como por ejemplo aquellos del género Thermus sp.. Son objetivo de la invención también en particular polinucleótidos que codifican para una citocromo P450 monooxigenasa según la definición de arriba, así como los polinucleótidos complementarios.

Los polinucleótidos preferidos son aquellos que esencialmente poseen una secuencia de ácidos nucleicos según SEQ ID NO: 1, así como la secuencia de ácidos nucleicos complementarios a ella.

Otro objetivo de la invención consiste en cintas de expresión para la producción recombinante de monooxigenasas acordes con la invención, que incluyen al menos una secuencia reguladora de ácidos nucleicos enlazada de modo operativo con al menos uno de los polinucleótidos arriba indicados.

Otros objetivo de la invención se refiere a los vectores recombinantes, que portan al menos un polinucleótido o al menos una cinta de expresión según la definición de arriba; así como microorganismos que contienen al menos uno de tales vectores recombinantes; así como métodos para la producción de citocromo P450 monooxigenasas acordes con la invención, en los cuales se cultiva un microorganismo que produce la citocromo P450 monooxigenasa y se aísla la monooxigenasa del cultivo.

Las enzimas acordes con la invención y los mutantes que pueden derivarse de ellas son útiles como biocatalizadores para diferentes reacciones bioquímicas de oxigenación de compuestos orgánicos según la definición en las reivindicaciones de significado técnico. De modo análogo, pueden utilizarse también los microorganismos recombinantes acordes con la invención para la ejecución de tales reacciones de oxigenación.

De allí que otro objetivo de la invención se refiere a un método para la oxidación microbiológica de un compuesto orgánico según la definición de las reivindicaciones, donde se hace reaccionar este compuesto con al menos una citocromo P450 monooxigenasa acorde con la invención.

Preferiblemente se ejecuta este método de modo que a1) se cultiva un microorganismo recombinante según la definición de arriba en un medio de cultivo, en presencia del compuesto orgánico exógeno (añadido desde afuera) o formado de modo intermedio, el cual es un sustrato de la monooxigenasa, preferiblemente en presencia de oxígeno y dado el caso un donor de electrones; o a2) se incuba un medio de reacción que contiene el sustrato, preferiblemente en presencia de oxígeno y un donor de electrones, con una citocromo P450 monooxigenasa acorde con la invención; y b) se aísla del medio el producto de oxidación formado o un producto de reacción de él.

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1. Citocromo P450 monooxigenasa, caracterizada porque ella exhibe una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2, así como equivalentes funcionales de ella los cuales se diferencian de SEQ ID NO:2 por 1 a 30 adiciones, sustituciones, borrados y/o inversiones de aminoácidos y donde la modificación de la secuencia, determinada mediante el empleo del sustrato de referencia -ionona, no cambia la actividad de la monooxigenasa en más de ± 90%, donde la actividad es determinada bajo condiciones estandarizadas, es decir 0, 1 a 0, 5 M del sustrato, pH = 6 a 8 y T .

60. 70°C.

2. Citocromo P450 monooxigenasa según la reivindicación 1 de bacterias del género Thermus sp..

3. Citocromo P450 monooxigenasa según la reivindicación 2, de una bacteria de la especie Thermus thermophilus.

4. Polinucleótido, que codifica para una citocromo P450 monooxigenasa termoestable según una de las reivindicaciones 1 a 3, así como el polinucleótido complementario para ello.

5. Polinucleótido según la reivindicación 4 con una secuencia de ácidos nucleicos según SEQ ID NO: 1, así como la secuencia de ácidos nucleicos complementaria para ello.

6. Cinta de expresión que incluye al menos una secuencia reguladora de ácidos nucleicos enlazada de modo operativo con un polinucleótido según una de las reivindicaciones 4 o 5.

7. Vector recombinante que porta un polinucleótido según una de las reivindicaciones 4 o 5 o una cinta de expresión según la reivindicación 6.

8. Microorganismo recombinante, transformado o transfectado con al menos un vector recombinante según la reivindicación 7.

9. Método para la producción de una citocromo P450 monooxigenasa termoestable según una de las reivindicaciones 1 a 3, donde se cultiva un microorganismo recombinante según la reivindicación 8, el cual produce la citocromo P450 monooxigenasa termoestable y se aísla la monooxigenasa del cultivo.

10. Método para la oxidación microbiológica de un compuesto orgánico elegido de entre cicloalcanos y cicloalquenos dado el caso sustituidos, donde este compuesto reacciona con al menos una citocromo P450 monooxigenasa según una de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque

a1) se cultiva un microorganismo recombinante según la reivindicación 8 en un medio de cultivo en presencia del compuesto orgánico exógeno o formado intermedio elegido dado el caso entre cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos, el cual es un sustrato de la monooxigenasa; o a2) se incuba un medio de reacción que contiene sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa según una de las reivindicaciones 1 a 3; y b) se aísla del medio el producto de oxidación o un producto de reacción del mismo.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque se ejecuta la oxidación mediante cultivo de los microorganismos en presencia de oxígeno a una temperatura de cultivo de por lo menos aproximadamente 20°C y un valor de pH de aproximadamente 6 a 9.

13. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque como sustrato exógeno se añade en un medio al menos un compuesto elegido de entre cicloalcanos y cicloalquenos dado el caso sustituidos y se ejecuta la oxidación mediante reacción enzimática del medio que contiene sustrato en presencia de oxígeno a una temperatura de por lo menos aproximadamente 20°C y un valor de pH de aproximadamente 6 a 9, donde el medio que contiene sustrato contiene además, referido al sustrato, un exceso molar de aproximadamente 10 a 100 veces en equivalentes de reducción.

14. Birreactor, que incluye una enzima según una de las reivindicaciones 1 a 3 o un microorganismo recombinante según la reivindicación 8, en forma inmovilizada.

15. Empleo de una citocromo P450 monooxigenasa según una de las reivindicaciones 1 a 3, de un vector según la reivindicación 7, o de un microorganismo según la reivindicación 8, para la oxidación microbiológica de cicloalcanos y cicloalquenos dado el caso sustituidos.