CEPA MUTANTE DE LACTOCOCCUS LACTIS LACTIS Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ACETOÍNA.

Cepa mutante de Lactococcus lactis lactis y método para la producción industrial de acetoína. Campo de la técnica La presente invención se encuadra dentro del campo de los microorganismos obtenidos por mutación de cepas salvajes. En concreto, la presente invención se refiere a una nueva cepa de Lactococcus lactis lactis, derivada de la cepa silvestre NCIMB702118 y caracterizada por su elevada tasa de producción de acetoína así como a un procedimiento de producción de acetoína mediante fermentación por dicho microorganismo. Estado de la técnica La acetoína (3-hidroxi-2-butanona o acetilmetilcarbinol) es un compuesto orgánico aromatizante que, junto con el diacetilo (2,3-butanodiona o dimetilglioxal), es el que confiere el típico aroma a mantequilla presente en diversos derivados lácteos, tales como la mantequilla, la nata y algunos quesos. La acetoína presenta un elevado interés por su utilización como aroma, con potenciales aplicaciones como aditivo en diversos sectores industriales, como el alimentario, el farmacéutico y el cosmético. Aparte de esta utilidad como aditivo aromatizante, por la estructura química de la molécula, que es de pequeño tamaño y cuenta con varios grupos funcionales potencialmente reactivos, puede ser también de interés para la industria química como materia prima de partida para la síntesis de otras moléculas más complejas (building blocks) (Werpy, T. y Petersen, G., eds. (2004) Top Valué Added Chemicals From Biomass. Volume I: Results of Screening for Potential Candidates firom Sugars and Synthesis Gas. National Renewable Energy Laboratory, U.S. Department of Energy). La producción de acetoína puede llevarse a cabo mediante procedimientos de tipo químico o biotecnológico. Entre los métodos químicos de producción se encuentran la reducción parcial de diacetilo en presencia de cinc y ácidos, la oxidación electroquímica de la metil etil cetona (butanona), y la oxidación selectiva del 2,3-butanodiol. Entre estos métodos, el de mayor aplicación industrial es el que se realiza mediante la oxidación electroquímica de la metil etil cetona, compuesto derivado exclusivamente de materias primas petroquímicas. Si bien estos procedimientos de tipo químico pueden dar lugar a elevados rendimientos de acetoína, las severas condiciones de reacción necesarias y, sobretodo, la utilización de materias primas no renovables derivadas del petróleo, aconsejan el establecimiento de nuevos métodos de producción más sostenibles, a partir de materias primas renovables. Otro problema que presentan, además, los procedimientos químicos es que conducen a la generación de mezclas racémicas de los dos isómeros ópticos de la acetoína. Por otra parte, la acetoína puede producirse como resultado de la actividad metabólica de ciertos microorganismos. El ejemplo más conocido es su producción durante la fermentación llevada a cabo por ciertas cepas de las denominadas bacterias ácido lácticas, que se encuentran formando parte de los cultivos iniciadores (starters) utilizados en la fabricación de diversos derivados lácteos. Las bacterias ácido lácticas son un grupo de microorganismos Grampositivos, anaerobios facultativos, capaces de convertir los carbohidratos en ácido láctico por medio de un metabolismo homo- o heterofermentativo. Entre las cepas que han sido descritas como productoras de este compuesto, las principales pertenecen a los géneros Lactococcus, Lactobacillus y Leuconostoc. La ruta metabólica que conduce a la formación de acetoína ha sido extensamente estudiada en Lactococcus lactis y se conoce con gran detalle (Boumerdassi, H. y Cols. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 2293-2299; Hugenholtz, J. y Cols. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 4112-4114). La enzima -acetolactato sintasa cataliza la formación de -acetolactato a partir de dos moléculas de piruvato (con la pérdida concomitante de una molécula de CO 2). El acetolactato, que es una molécula inestable, puede seguir dos rutas alternativas: i) puede sufrir una descarboxilación oxidativa de tipo químico (en presencia de oxígeno) para dar diacetilo, o ii) puede originar acetoína por descarboxilación enzimática catalizada por la -acetolactato descarboxilasa (la vía mayoritaria). El diacetilo formado puede, a su vez, ser transformado en acetoína mediante la acción de la diacetilo deshidrogenasa o reductasa, con la consiguiente oxidación del cofactor NADH a NAD + . Finalmente, la acetoína puede dar lugar a 2,3-butanodiol, en una reacción catalizada por la acetoína deshidrogenasa o reductasa (que realmente es la misma enzima que la diacetilo reductasa), con la oxidación de una segunda molécula de NADH a NAD + (Figura 1). La ruta principal del metabolismo del piruvato es la formación de lactato, por medio de una reacción catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa (Neijssel, O.M. y Cols. (1997) J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 83: 12S-19S). Esta enzima cataliza la reducción de piruvato a lactato utilizando NADH como cofactor, que se oxida a NAD + . El NADH requerido para esta reacción es generado durante la glucolisis, y debe ser reoxidado a NAD + para que esta ruta metabólica pueda seguir funcionando. Por tanto, en condiciones de anaerobiosis, con elevados flujos glucolíticos, el lactato es prácticamente el único producto final que se obtiene como resultado del metabolismo de los azúcares, resultando en lo que se denomina fermentación homoláctica (Platteeuw, C. y Cols. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61: 3967-3971). En otras condiciones, tales como las que ocurren cuando la velocidad del metabolismo glucídico se reduce o en condiciones aeróbicas, se observa un desplazamiento del metabolismo hacia una fermentación ácidomixta o heteroláctica (Neijssel, O.M. y Cols. (1997) J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 83: 12S-19S), resultando en la formación de otros metabolitos (acetato, formato, etanol, acetoína, diacetilo) además del lactato. 2 ES 2 352 633 A1 En el campo de la técnica, se ha intentado conseguir cepas bacterianas con una producción incrementada de acetoína, mediante la inactivación de la actividad lactato deshidrogenasa puesto que, ya que la inmensa mayoría del piruvato celular es transformado en lactato por medio de la enzima lactato deshidrogenasa, la inactivación de esta enzima debería conducir a una mayor disponibilidad del piruvato para las demás rutas metabólicas. Experimentalmente se ha demostrado que la producción de acetoína aumenta en cepas deficientes en actividad lactato deshidrogenasa obtenidas tanto por mutagénesis al azar (Boumerdassi, H. y Cols. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 2293-2299; Monnet, C. y Cols. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 5518-5520) como por inactivación dirigida (Platteeuw, C. y Cols. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61: 3967-3971) del gen que codifica esa enzima. Las cepas resultantes mostraban un significativo incremento (superior a un orden de magnitud) en la síntesis de acetoína. La patente europea EP0928333 describe un método para la obtención de cepas de Lactococcus lactis dobles mutantes en la lactato deshidrogenasa y en la piruvato formato liasa, que producen mayores cantidades de -acetolactato y su metabolito acetoína. El estado de la técnica comprende también estrategias de sobreexpresión de la actividad -acetolactato sintasa: esta enzima es la primera específica de la ruta de biosíntesis de acetoína. En principio, podría esperarse que su sobreexpresión causara un mayor flujo del piruvato a través de esta ruta. Sin embargo, el elevado valor de su K m hacia el piruvato (50 mM) supone una gran limitación en lo referente a la utilidad real de esta estrategia, y los resultados experimentales así lo han corroborado. De hecho, la sobreexpresión de dicha enzima en un factor de hasta 20 veces ha ocasionado incrementos en la síntesis de acetoína prácticamente imperceptibles (Platteeuw, C. y Cols. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61: 3967-3971). La patente europea EP0663955 trata sobre el aislamiento de un ácido nucleico que codifica la enzima -acetolactato descarboxilasa y la utilización de éste, empleando técnicas de ingeniería genética, en la obtención de cepas de Lactococcus lactis con mayores producciones de acetoína o diacetilo. La patente francesa FR2777905 trata sobre la obtención de bacterias sobreproductoras de -acetolactato y/o diacetilo, empleando procedimientos de obtención de mutantes en las enzimas lactato deshidrogenasa y -acetolactato descarboxilasa. Alternativamente, se utiliza en el estado de la técnica, la sobreexpresión de la actividad NADH oxidasa: Un factor primordial en la regulación de los flujos a través de las diferentes rutas del metabolismo del piruvato es el estado redox celular, en concreto, la relación NADH/NAD + . Valores elevados de esta relación favorecen la formación de lactato. Valores reducidos incrementan la participación... [Seguir leyendo]

1. Cepa bacteriana de Lactococcus lactis lactis, derivada de la cepa silvestre NCIMB702118, caracterizada porque su actividad lactato deshidrogenasa se encuentra en un rango de entre 0,50-0,75 U/mg, que ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo bajo el número CECT 7512. 2. Cepa bacteriana según la reivindicación 1, cuya actividad NADH oxidasa se encuentra en un rango de entre 0,60-0,70 U/mg. 3. Cepa bacteriana según alguna de las reivindicaciones 1 ó 2 cuya producción de acetoína se encuentra en un rango de entre 45-461 mM en el medio de cultivo. 4. Cepa bacteriana según alguna de las reivindicaciones 1 ó 2 cuya producción de acetoína es superior a 70 g/l en el medio de cultivo, para cultivos en semicontínuo. 5. Procedimiento de producción de acetoína, que comprende la fermentación aeróbica de carbohidratos por una cepa bacteriana según la reivindicación 1. 6. Procedimiento de producción de acetoína según la reivindicación 5 que comprende los pasos de: (a) Precultivo de una cepa según la reivindicación 1. (b) Inoculación de un medio rico en carbohidratos con el precultivo obtenido en (a) (c) Fermentación de los carbohidratos del medio inoculado en (b) a 15-40ºC; pH 5,5-7,0 (d) Separación del medio fermentado en (c) de las células. (e) Opcionalmente, purificación de la acetoína vertida al medio durante la fermentación (c). 7. Procedimiento de producción de acetoína según alguna de las reivindicaciones 5 ó 6, donde el carbohidrato utilizado comprende moléculas de glucosa, fructosa o sacarosa. 8. Procedimiento de producción de acetoína según alguna de las reivindicaciones 5-7, donde el paso (c) de fermentación se realiza en un rango de saturación de 02 de entre el 30-100%. 9. Procedimiento de producción de acetoína según alguna de las reivindicaciones 5-7, donde la concentración inicial de carbohidrato es igual o superior a 100 g/L. ES 2 352 633 A1 11 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA