Cajas bioactivas para cultivos celulares.

Cajas bioactivas para cultivos celulares que constan sobre su fondo de una bicapa que comprende una capa primaria interna de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),

o de alcohol polivinílico (PVA), en contacto con el fondo de las cajas, y una capa bioactiva externa de carboximetilcelulosa (CMC) situada sobre dicha capa interna.

Cajas bioactivas para cultivos celulares.

La presente invención tiene como objeto unas cajas bioactivas para cultivos celulares, y sus usos para la puesta en práctica de procedimientos para el estudio del envejecimiento celular, de la diferenciación celular y de la apoptosis, de procedimientos de cribado de moléculas antiedad, de procedimientos de cribado de moléculas antitumorales, de procedimientos de diagnóstico in vitro de la malignidad de las células tumorales y por lo tanto de procedimientos de diagnóstico in vitro de tumores, o de procedimientos de estudios que se refieren a las investigaciones sobre la señalización que regula la morfología, la bioadhesión, la proliferación celular y la comunicación intercelular.

Los estudios de los inventores se centraron inicialmente en la utilización de membranas de cuprofano que se colocaban en el fondo de las cajas de Petri, después se ensayaron los revestimientos PVP (polivinilpirrolidona) , HEC (hidroxietilcelulosa) , HPMC (hidroxipropilmetilcelulosa) y CMC (carboximetilcelulosa) . Las ventajas e inconvenientes de dichos materiales se resumen a continuación.

1) la membrana de cuprofano Características principales:

- Estabilidad: 48 horas

- Morfología celular agregada (formación de agregados celulares) y/o redondeados

- Resulta conveniente para los estudios de señalización celular a los 45, 90 y 180 minutos (Faucheux et al., 1998, 1999, 2000, 2001, y 2002, y Duval et al., 1999)

- proliferación celular reducida

- inductora de la apoptosis (principalmente sobre los fibroblastos Swiss 3T3) . Principales inconvenientes:

- difíciles de utilizar (pliegues) , - imposibilidad de transferencia a nivel industrial, -ya no se fabrican comercialmente. 2) revestimiento de PVP Características principales:

- morfología celular extendida (resultados idénticos a los obtenidos sobre el control poliestireno (PS) ) Por lo tanto, este revestimiento es inutilizable. 3) revestimiento de HEC Características principales:

- Estabilidad: 48 horas - morfología celular agregada -proliferación celular ligeramente reducida Principales inconvenientes:

- dificultad de puesta en práctica para tener un deposito regular sobre el soporte 4) revestimiento de HPMC Características principales:

- Estabilidad: 48 horas - morfología celular agregada - proliferación celular reducida

- revestimiento que cubre bien y de forma homogénea y fácil de aplicar

- revestimiento utilizable para la inyección de células agregadas a los 90 minutos (cuprofano desfavorable debido a los pliegues) por ejemplo, estudio de funcionalidad de las juntas comunicantes mediante la inyección de amarillo de Lucifer.

Su principal inconveniente radica en el hecho que no permite la activación de las células por un tiempo superior a algunas horas.

5) revestimiento de CMC

Características principales:

- Estabilidad: 48 horas y más

- morfología celular agregada y/o redondeada

- proliferación celular reducida

Inconveniente: recubrimiento incompleto del soporte: un anillo de PS resulta accesible para las células en la periferia (puesta en práctica bastante difícil, poco industrializable) . La presente invención deriva de la puesta en evidencia por parte de los inventores de que la bicapa HPMC (o alcohol polivinílico (PVA) ) -CMC permite paliar los inconvenientes de los revestimientos estudiados anteriormente. Las ventajas de la bicapa HPMC o PVA sobre CMC son las siguientes:

- Revestimiento que cubre fácilmente y fácil de fabricar

- Estabilidad: por lo menos 5 días

- Esterilizable

- Morfología celular agregada (fibroblastos Swiss 3T3, L929, melanomas, líneas de osteoblastos como MC 3T3 E14 y MC 3T3 E1 24) o redondeadas (fibroblastos humanos)

- Proliferación celular reducida (melanomas B16C3, B16F0, B16F10) , MC 3T3·, fibroblastos murinos Swiss 3T3 y L929.

- Diferenciación de las células control mediante la síntesis de melanina y una actividad tirosinasa aumentada para las 3 líneas de melanoma.

- Apoptosis inducida a las 24 y 48 horas: actividad caspasa 3 aumentada a las 24 y 48 horas y actividad caspasa 9 aumentada a las 6 horas para los fibroblastos Swiss 3T3.

La presente invención tiene como objeto unas cajas bioactivas para cultivos celulares que presentan en el fondo una bicapa que comprende una capa primaria interna de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) o de alcohol polivinílico (PVA) , en contacto con el fondo de las cajas, y una capa bioactiva externa de carboximetilcelulosa situada sobre dicha capa interna.

Las cajas bioactivas mencionadas anteriormente de la invención se caracterizan además porque se presentan en forma de cajas de Petri, como las cajas de petri en poliestireno de origen comercial, o en forma de placas con varios pocillos, en el fondo de las cuales se sitúa la bicapa.

Ventajosamente, las capas bioactivas mencionadas anteriormente en la invención se caracterizan porque los grosores de la capa interna de HPMC o de PVA, y de la capa externa de CMC, son de algunas micras, principalmente de 1 a 5 micras.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de cajas bioactivas como las mencionadas anteriormente, caracterizada porque comprende:

- una etapa de activación de la superficie del fondo de las cajas mediante descargas electromagnéticas,

- el depósito de la capa interna de HPMC sobre el fondo de las cajas y después el secado,

- el depósito de la capa bioactiva externa sobre la capa primaria seca obtenida mediante la etapa anterior, después secado.

La invención tiene como objeto asimismo la utilización de cajas bioactivas como las definidas anteriormente, para poner en práctica:

- unos procedimientos de estudio del envejecimiento celular, de la diferenciación celular y de la apoptosis,

- unos procedimientos de cribado de moléculas antiedad destinadas a prevenir y retrasar los efectos del envejecimiento,

- unos procedimientos de cribado de moléculas antitumorales destinadas al tratamiento de los cánceres (búsqueda de un efecto potenciador o acumulativo en relación con el efecto inductor del revestimiento) ,

- unos procedimientos de diagnóstico in vitro de la malignidad de las células tumorales midiendo la capacidad

residual de las células cancerosas para diferenciarse, y para entrar en apoptosis y por lo tanto de procedimiento 15 de pronóstico in vitro de tumores,

- o unos procedimientos de estudios que se refieren a investigaciones sobre la señalización que regulan la morfología, la bioadhesión, la proliferación celular y la comunicación intercelular.

La invención tiene como objeto más particularmente un procedimiento de estudio del envejecimiento celular, la diferenciación celular y de la apoptosis, caracterizado porque comprende:

- una etapa de cultivo de las células a estudiar en las cajas definidas anteriormente,

-la observación de las células mediante microscopio para estudiar su morfología,

- y/o la detección, incluso la cuantificación, de una diferenciación celular, mediante la proliferación celular, de las proteínas sintetizadas, de los marcadores de membrana específicos expresados,

- y/o la detección, incluso la cuantificación, de la apoptosis de las células, midiendo la viabilidad (ensayo de exclusión al azul de tripán) de la activación de las caspasas (procedimientos fluorométricos o colorimétricos, transferencia western) , de la fragmentación de la cromatina (ensayo TUNEL) o de la formación de cuerpos apoptóticos (coloración de Hoechst) .

La invención tiene asimismo como objeto un procedimiento de cribado de las moléculas antiedad destinadas a prevenir y a retrasar los efectos del envejecimiento, caracterizado porque comprende:

- una etapa de cultivo de células, como los fibroblastos, en presencia de las moléculas antiedad que se deben estudiar, en las cajas de cultivo definidas anteriormente,

- la observación de las células mediante microscopio para estudiar su morfología,

- y/o la detección, incluso la cuantificación, de la proliferación, de síntesis, principalmente de las proteínas

celulares como el colágeno, 45

- y la comparación con las observaciones y resultados obtenidos en cultivos de células utilizadas como control, dichos cultivos control se preparan cultivando dichas células en ausencia de dichas moléculas antiedad a estudiar, en las cajas definidas anteriormente. [Seguir leyendo]

1. Cajas bioactivas para cultivos celulares que constan sobre su fondo de una bicapa que comprende una capa primaria interna de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) , o de alcohol polivinílico (PVA) , en contacto con el fondo de las cajas, y una capa bioactiva externa de carboximetilcelulosa (CMC) situada sobre dicha capa interna.

2. Cajas bioactivas según la reivindicación 1, caracterizadas porque se presentan en forma de cajas de petri, como las cajas de petri de poliestireno de origen comercial, o en forma de placas con múltiples pocillos, en el fondo de las cuales se sitúa la bicapa.

3. Cajas bioactivas según la reivindicación 1 o 2, caracterizadas porque los grosores de la capa interna de HPMC o de PVA, y de la capa externa de CMC, son de algunas micras, particularmente de aproximadamente 1 a 5 micras.

4. Procedimiento de preparación de las cajas bioactivas según una de las reivindicación 1 a 3, caracterizado porque comprende:

- una etapa de activación de la superficie del fondo de las cajas mediante descargas electromagnéticas,

- depositar la capa interna de HPMC sobre el fondo de las cajas, y secar a continuación,

- depositar la capa bioactiva externa sobre la capa primaria seca obtenida en la etapa anterior, secar a continuación.

5. Utilización de las cajas bioactivas según una de las reivindicaciones 1 a 3, para poner en práctica:

- los procedimientos de estudio del envejecimiento celular, de la diferenciación celular y de la apoptosis,

- los procedimientos de cribado de moléculas antiedad destinadas a prevenir y retrasar los efectos del envejecimiento,

- los procedimientos de cribado de moléculas antitumorales destinadas al tratamiento de los cánceres,

- los procedimientos de diagnóstico in vitro de la malignidad de las células tumorales midiendo la capacidad residual de las células cancerosas para diferenciarse, y para iniciar la apoptosis y por lo tanto los procedimientos de pronóstico in vitro de tumores,

- o los procedimientos de estudios que se refieren a las investigaciones sobre la señalización que regula la morfología, la bioadhesión, la proliferación celular y la comunicación intercelular.

6. Procedimiento de estudio del envejecimiento celular, de la diferenciación celular, y de la apoptosis, caracterizado porque comprende:

- una etapa de cultivo de las células que se deben estudiar sobre las cajas definidas en una de las reivindicaciones 1 a 3,

- observar las células al microscopio para estudiar su morfología,

- y/o detectar, incluso cuantificar, una diferenciación celular, mediante la medición de la proliferación celular, de proteínas sintetizadas, de marcadores de membrana específicos expresados,

- y/o detectar, incluso cuantificar, la apoptosis de las células, mediante la medición de la viabilidad, de la activación de las caspasas, de la fragmentación de la cromatina o de la formación de cuerpos apoptóticos.

7. Procedimiento de cribado de moléculas antiedad destinadas a prevenir y retrasar los efectos del envejecimiento, caracterizado porque comprende:

- una etapa de cultivo de las células, tales como los fibroblastos, en presencia de unas moléculas antiedad que se deben estudiar, sobre las cajas de petri definidas en una de las reivindicación 1 a 3,

- observar las células mediante microscopio para estudiar su morfología,

- y/o detectar, incluso cuantificar, la proliferación, y la síntesis,

- y comparar con las observaciones y los resultados obtenidos en los cultivos de las células utilizadas como control, realizándose dichos cultivos control cultivando dichas células en ausencia de dichas moléculas antiedad que se deben estudiar, sobre las cajas definidas en una de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Procedimiento de cribado de moléculas antitumorales destinadas al tratamiento de cánceres, caracterizado porque comprende.

5. una etapa de cultivo de las células, tales como las células de melanoma animales o humanas, en presencia de unas moléculas antitumorales que se deben estudiar, sobre las cajas definidas en una de las reivindicación 1 a 3,

- observar las células al microscopio para estudiar su morfología y su diferenciación.

10. y/o detectar, incluso cuantificar, su proliferación, diferenciación y apoptosis,

- y comparar con las observaciones y resultados obtenidos en los cultivos de las células utilizadas como control, realizándose dichos cultivos control cultivando dichas células en ausencia de dichas moléculas antitumorales que se deben estudiar, sobre las cajas definidas en una de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Procedimiento de diagnóstico in vitro de la malignidad de células tumorales mediante la medición de la capacidad residual de las células cancerosas para diferenciarse, caracterizado porque comprende:

- una etapa de cultivo de células cancerosas, tales como unas células de melanomas humanos obtenidas a partir 20 de biopsias, sobre las cajas de petri definidas en una de las reivindicaciones 1 a 3;

- observar al microscopio las células para estudiar su morfología y diferenciación, y/o detectar incluso cuantificar, su proliferación, la viabilidad y la apoptosis.

10. Aplicación del procedimiento de diagnóstico según la reivindicación 9, al pronóstico in vitro de tumores.