BIOCINÉTICA DE POLIPÉPTIDOS DE ELIMINACIÓN RÁPIDA.

En general el campo de la invención se refiere a polipéptidos que son capaces de unirse a una diana. Más específicamente, el campo de la invención se refiere a agentes de unión de bajo peso molecular que demuestran una biocinética favorable y a procedimientos de formación de imágenes que usan dichos agentes de unión de eliminación rápida. Antecedentes La unión específica de una diana en una muestra puede lograrse usando una diversidad de agentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, aficuerpos, anticalinas, aptámeros. Los agentes de unión de alto peso molecular tales como anticuerpos se desaprueban para algunas aplicaciones in vivo (por ejemplo, para aplicaciones de formación de imágenes) porque necesitan mucho tiempo para migrar al sitio diana, demuestran una escasa penetración tisular, permanecen en el sujeto durante mucho tiempo, se eliminan principalmente a través del hígado y es más probable que produzcan una respuesta inmune que agentes de unión de menor tamaño. Por consiguiente, para algunas aplicaciones in vivo, se prefieren agentes de unión de bajo peso molecular de eliminación rápida para una migración rápida a un sitio diana, penetración tisular y eliminación rápida del cuerpo. Un agente de unión de eliminación rápida es el aficuerpo, un polipéptido de 7 kDa basado en el dominio z de la proteína A. Todos los aficuerpos comparten un plegamiento proteico de triple hélice común. Los aficuerpos contra nuevas dianas se generan por aleatorización de los 13 restos de aminoácidos en la superficie de unión a IgG usando técnicas de presentación en fago o levadura. Las proteínas maduradas por afinidad se producen como un solo dominio de 7 kDa (aficuerpo monovalente) o como dos dominios de 7 kDa en tándem (aficuerpo bivalente). Los agentes de unión de eliminación rápida que están particularmente bien adaptados para algunas aplicaciones in vivo debido a su penetración tisular y baja antigenicidad, pueden no obstante eliminar un cuerpo de un modo que interfiera con aplicaciones deseadas. Por ejemplo, la eliminación a través del hígado podría interferir con aplicaciones de formación de imágenes basadas en el hígado; la eliminación a través del riñón de un agente de unión radiomarcado podría dar como resultado una dosis de radiación inaceptable en los riñones; o la eliminación rápida desde la sangre podría tener que ralentizarse para conseguir la penetración de tejidos difíciles de acceder. El documento de JEONG y col. vol. 21, 107, 1 Oct. 1994, páginas 935-940 estudia el efecto en el pI sobre la biodistribución in vivo de avidina, y también aborda la cuestión de reducir la asimilación hepática y renal. Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos para modificar la biocinética de agentes de unión de eliminación rápida. Además, existe la necesidad de agentes de unión de eliminación rápida afinados biocinéticamente para la formación de imágenes in vivo que puedan usarse para una diversidad de modalidades de formación de imágenes para la formación de imágenes preclínicas o de diagnóstico. Breve descripción En el presente documento se proporcionan procedimientos de reducción de la asimilación hepática de un polipéptido de eliminación rápida que se une específicamente a una diana, que comprenden: proporcionar un polipéptido que se une específicamente a una diana; y sustituir al menos un resto de aminoácido básico o al menos un resto de aminoácido neutro con un resto de aminoácido ácido para producir un polipéptido modificado, en los que el polipéptido modificado demuestra un punto isoeléctrico de al menos 0,05-0,1 puntos de pH menos que el punto isoeléctrico del polipéptido nativo. En algunas realizaciones, la semivida en sangre del polipéptido modificado es sustancialmente la misma que la semivida en sangre del polipéptido nativo y la asimilación hepática del polipéptido modificado se reduce sustancialmente respecto al polipéptido nativo. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste esencialmente en aproximadamente 60 restos de aminoácidos que comprenden un plegamiento alfa helicoidal o aproximadamente 120 restos de aminoácidos que comprenden un par de segmentos de plegamiento alfa helicoidal. Como alternativa, el polipéptido puede consistir esencialmente en aproximadamente 160 restos de aminoácidos que comprenden un plegamiento de tipo barril beta. En todas las realizaciones, el polipéptido modificado conserva la afinidad de unión por su diana nativa y, por lo tanto, se une a la diana con una especificidad de al menos el 50%, 75%, 90% del polipéptido no modificado. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos básicos se seleccionan de histidina, lisina y arginina y los restos de aminoácidos ácidos se seleccionan de ácido aspártico o ácido glutámico. Los restos de aminoácidos neutros pueden seleccionarse de cualquier resto de aminoácido distinto de histidina, lisina, arginina, ácido aspártico o ácido glutámico y los restos de aminoácidos ácidos se seleccionan de ácido aspártico o ácido glutámico, y derivados de los mismos. 2 E08863248 03-01-2012   Puede añadirse un generador de señal tal como un generador de señal opaca radiactiva, fluorescente, magnética, radiopaca (por ejemplo, 99m Tc o 18 F), luminescente, fosforescente, isotópica o de ultrasonidos al polipéptido modificado. Opcionalmente, o además, se añade un resto de dirección al polipéptido modificado. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos generados de acuerdo con los procedimientos desvelados, incluyendo un polipéptido aislado que consiste esencialmente en los restos de aminoácidos de las SEC ID números 1-9. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos modificados de la invención. También se proporcionan en el presente documento agentes de formación de imágenes in vivo que comprenden el polipéptido modificado y el generador de señal. También se proporcionan en el presente documento procedimientos de reducción de las interferencias de fondo en el hígado durante un procedimiento de formación de imágenes in vivo usando un polipéptido que se une a una diana. FIGURAS La FIG. 1 muestra la eliminación sanguínea para 5 aficuerpos monoméricos que se han modificado de acuerdo con las enseñanzas del presente documento. El porcentaje de la cantidad inyectada total de aficuerpo que queda en la sangre (en circulación) se muestra en el eje y. El tiempo post-inyección se muestra en el eje x. Los datos demuestran que a pesar de la variación de secuencia, los aficuerpos muestran unas características de eliminación similares. La FIG. 2 muestra la eliminación renal y hepática para 5 aficuerpos monoméricos. El porcentaje de la cantidad inyectada total de aficuerpo que queda en cada gramo de tejido se muestra para el hígado (panel 2A) y para el riñón (panel 2B), representado frente al tiempo transcurrido después de la inyección. Los datos demuestran un amplio intervalo de valores de retención, que muestran que la variabilidad de secuencia dentro del panel de aficuerpos es suficiente para dirigirlos al hígado o a los riñones para su eliminación. La FIG. 3 muestra la correlación de la eliminación de aficuerpos mediado por hígado y riñón. Los dos están inversamente correlacionados, mostrando que los aficuerpos se eliminan del torrente sanguíneo tanto por el hígado como por los riñones, y que la variación de secuencia en este panel de aficuerpos es suficiente para desplazar esta eliminación de un modo u otro. La FIG. 4 muestra la correlación de la asimilación hepática y del punto isoeléctrico. El punto isoeléctrico y la retención hepática observada a las 2 horas post-inyección se representan y se ajustan con una regresión lineal. La correlación tiene un valor de r cuadrado de más de 0,98. La FIG. 5 muestra la eliminación sanguínea para 2 aficuerpos diméricos. El porcentaje de la cantidad inyectada total de aficuerpo que queda en la sangre (en circulación) se muestra en el eje y. El tiempo post-inyección se muestra en el eje x. Los datos demuestran que a pesar de la variación de secuencia, los aficuerpos muestran características de eliminación similares. La FIG. 6 muestra la eliminación renal y hepática para aficuerpos diméricos. El porcentaje de la cantidad inyectada total de aficuerpo que queda en cada gramo de tejido se muestra para hígado (izquierda) y riñón (derecha) representado frente al tiempo transcurrido después de la inyección. Los datos demuestran un amplio intervalo de valores de retención, demostrando que la variabilidad de secuencia dentro del panel de aficuerpos es suficiente para dirigirlos al hígado o a los riñones para su eliminación. La FIG. 7 muestra la correlación de la asimilación hepática y del punto isoeléctrico. El punto isoeléctrico y la retención hepática... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de reducción de la asimilación hepática in vivo de un polipéptido que se une específicamente a una diana, que comprende: (a) proporcionar un polipéptido que se une específicamente a una diana; y (b) sustituir al menos un resto de aminoácido básico o al menos un resto de aminoácido neutro del polipéptido nativo de la etapa (a) con un resto de aminoácido ácido para producir un polipéptido modificado, en el que el polipéptido modificado demuestra un punto isoeléctrico al menos 0,05-0,1 puntos de pH inferior al punto isoeléctrico del polipéptido nativo de la etapa (a); y en el que el polipéptido modificado se une a la diana con al menos el 50%, 75% o 90% de la especificidad del polipéptido nativo. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los restos de aminoácidos básicos se seleccionan de histidina, lisina y arginina, y los restos de aminoácidos ácidos se seleccionan de ácido aspártico o ácido glutámico. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que los restos de aminoácidos neutros se seleccionan de cualquier resto de aminoácido distinto de histidina, lisina, arginina, ácido aspártico o ácido glutámico, y los restos ácidos se seleccionan de ácido aspártico o ácido glutámico y derivados de los mismos. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido modificado consiste en: (i) aproximadamente 60 restos de aminoácidos que comprenden un plegamiento alfa helicoidal; (ii) aproximadamente 120 restos de aminoácidos que comprenden un par de segmentos de plegamiento alfa helicoidal; (iii) aproximadamente 160 restos de aminoácidos que comprenden un plegamiento de tipo barril beta. 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido modificado consiste en los restos de aminoácidos de las SEC ID números 1-8. 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido modificado comprende además un resto de dirección. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido modificado comprende además un generador de señal, seleccionado de un generador de señal opaca radiactiva, fluorescente, magnética, radiopaca, luminescente, fosforescente, isotópica o de ultrasonidos. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el generador de señal comprende 99m Tc o 18 F. 9. Un polipéptido modificado que consiste en los restos de aminoácidos de las SEC ID números 1-8. 10. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido modificado de la reivindicación 9. 11. Un agente de formación de imágenes de diagnóstico que comprende el polipéptido modificado con un generador de señal como se define en la reivindicación 7 o la reivindicación 8. 12. El agente de formación de imágenes de diagnóstico de la reivindicación 11, que se proporciona como una composición farmacéutica. 13. Un agente de formación de imágenes de diagnóstico de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, para su uso en un procedimiento de formación de imágenes in vivo. 18 E08863248 03-01-2012   19 E08863248 03-01-2012   E08863248 03-01-2012   21 E08863248 03-01-2012   22 E08863248 03-01-2012   23 E08863248 03-01-2012   24 E08863248 03-01-2012   E08863248 03-01-2012