PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR LA PRESENTACIÓN DE CLASE I DE ANTÍGENOS EXÓGENOS POR CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS.

Un procedimiento para promover el procesamiento de un antígeno por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de clase I por medio de células dendríticas (CD) humanas,

en el que dichas CD se exponen in vitro a un antígeno asociado con una célula tumoral en presencia del bacilo de Calmette Guerin (BCG) o BCG con lipopolisacárido (LPS) como factor o agente que promueve el procesamiento del antígeno por el CMH de clase I.

Procedimiento para aumentar la presentación de clase I de antígenos exógenos por células dendríticas humanas Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de Estados Unidos Nº 60/203.758, presentada el 12 de mayo de 2000.

Antecedentes de la invención Es bien sabido que el sistema inmunitario puede funcionar para destruir las células tumorales, incluyendo las células cancerosas tanto primarias como metastásicas. De hecho, la prueba de que el sistema inmunitario reconoce la presencia de células neoplásicas cancerosas se apoya en la existencia de linfocitos infiltrantes en los tejidos tumorales (Haskill y col. Contemp. Top. Immunobiol. 8: 107-170 (1978) ; Vose and Moore, Semin. Hematol. 22: 27-40 (1985) ) . A pesar de la presencia de las células inmunitarias, los tumores suelen prevalecer, y no sólo sobrevivir, sino también metastatizar hacia sitios distantes con un crecimiento sin restricciones.

Recientes avances en la comprensión de la activación de las células T y el reconocimiento de las células diana han permitido realizar algunos progresos en el desarrollo de la inmunoterapia del cáncer mediada por células T (Schwartz, Cell 71: 1065-1068 (1992) ; Pardoll, Curr. Opin. Immunol. 4: 619-623 (1992) ) .

El sistema inmunológico se desarrolla a partir de una célula progenitora única pluripotencial en los principales subgrupos de células linfoides y mieloides. Las células linfoides comprenden las células B y las células T. Las células mieloides incluyen los macrófagos, monocitos y neutrófilos. Las células inmunitarias son capaces de permanecer en circulación, buscar antígenos extraños y eliminarlos.

En el subgrupo linfoide, la respuesta inmunitaria da lugar a la activación de las células T ayudantes (TH, del inglés T helper) , que son positivas para la expresión de la molécula de superficie CD4+ y de las células T citotóxicas (TC) , que son positivas para la expresión de la molécula de superficie CD8+. Las células T se activan a través de la interacción con las células presentadoras de antígenos (CPA) , que expresan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I o clase II, asociadas con fragmentos antigénicos. Las secuencias de aminoácidos antigénicos asociadas derivan específicamente de los antígenos procesados.

Las CPA utilizan dos procedimientos alternativos para presentar los antígenos en función de la fuente del antígeno. El antígeno exógeno, soluble sufre un proceso de endocitosis en las vacuolas y de degradación por el pH bajo. Los fragmentos de péptidos resultantes se dirigen a continuación a las proteínas del CMH de clase II y se presentan en la superficie celular. La presentación en el CMH de clase I requiere que los antígenos sean degradados en el citosol y transportados por el sistema de transporte TAP al retículo endoplasmático. Por lo general, para que esto suceda es necesario que el antígeno se encuentre en el citosol, por ejemplo en el caso de una infección viral o por traducción celular, y a continuación los péptidos resultantes se asocian con el CMH de clase I.

El complejo antígeno-CMH es reconocido por el receptor específico de las células T que reconoce el antígeno y las moléculas CD4 y CD8 de la superficie. CD4 y CD8 interactúan con regiones conservadas de una sola clase de CMH cada una. Mientras que el CMH de clase II es reconocido por las células TH debido a la interacción con CD4, la presentación al CMH de clase I se limita a la activación de las células TC a través de la interacción con CD8.

La activación de las células T que no han recibido estímulo previo y las que ya están cebadas sigue un mecanismo definido. Las CPA presentan los antígenos endógenos en el CMH de clase I y los antígenos exógenos solubles en el CMH de clase II. Los complejos antígeno-CMH de clase I o CMH de clase II interactúan con CD8 o CD4 respectivamente, y también interactúan con el receptor de las células T específico para el antígeno. Tras esta interacción específica, moléculas secundarias tales como la º-microglobina y CD28 desencadenan la activación de las células T que a su vez ejercen la respuesta inmunitaria apropiada.

Las células T CD4+ sensibilizadas o “cebadas” producen quimiocinas que participan en la activación y el reclutamiento de las células B, así como varios subgrupos de células T. La cantidad de células T CD8+ sensibilizadas aumenta en respuesta a las linfocinas y son capaces de destruir cualquier célula que exprese los fragmentos antigénicos específicos asociados con las moléculas del CMH de clase I correspondientes (Jondal y col., Immunity 5: 295-302 (1996) ) .

Los linfocitos infiltrados en el tejido tumoral representan la prueba de que los tumores cancerosos inducen la aparición de linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ capaces de erradicar los antígenos asociados al cáncer o específicos del cáncer, lo que limita la progresión de la extensión del tumor y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, con frecuencia los tumores crecen y hacen metástasis, superando esta inmunidad natural. Se han sugerido diversos procedimientos de inmunoterapia dirigidos a una serie de tipos de cáncer en particular para mejorar esta respuesta inmunitaria natural, sin embargo, la principal dificultad ha sido la inducción de CPA para presentar los antígenos solubles asociados a tumores humanos o antígenos específicos de tejido a través del CMH de clase I. Experimentos recientes en sistemas murinos han demostrado que la activación de linfocitos T

citotóxicos in vitro pueden conferir una protección potente del crecimiento de los tumores singénicos in vivo (Fields y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9482-9487 (1998) ) . Sin embargo, los experimentos en el sistema inmunitario murino no son completamente predictivos de la respuesta inmunitaria humana. Hasta la fecha no existen procedimientos terapéuticos que provoquen con éxito una respuesta de inmunoterapia eficaz de los LTC humanos contra el cáncer primario o metastásico utilizando CPA incubadas con una proteína soluble o un antígeno proteico.

Las células presentadoras de antígeno (CPA) son particularmente importantes en la obtención de una respuesta inmune eficaz. Por definición, las CPA no solo presentan antígenos a las células T con receptores de células T específicos de antígeno, sino que aportan todas las señales necesarias para la activación de las células T. Las señales necesarias para la activación de las células T no están totalmente definidas, pero probablemente incluyan una diversidad de moléculas de superficie celular, así como las citocinas o los factores de crecimiento. Además, los factores necesarios para la activación de las células T no estimuladas previamente o no cebadas pueden ser diferentes de los requeridos para la reactivación de las células T de memoria previamente cebadas. Comúnmente se conoce a la capacidad de las CPA de presentar antígenos y enviar señales para la activación de las células T como una función celular accesoria. Aunque se ha demostrado que los monocitos y las células B son CPA competentes, su capacidad para presentar antígenos in vitro parece estar limitada a la reactivación de las células T previamente sensibilizadas. Por lo tanto, no son capaces de activar directamente las poblaciones de células T funcionalmente no estimuladas o no cebadas.

La expresión “células dendríticas” se refiere a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides (Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296 (1991) ) . Estas células incluyen las células dendríticas linfoides del bazo, las células de Langerhans de la epidermis y las células veladas en el torrente circulatorio sanguíneo. A pesar de que se clasifican colectivamente como un grupo en base a su morfología, los altos niveles de expresión superficial del CMH de clase II, y la ausencia de ciertos otros marcadores de superficie expresados en las células T, células B, monocitos y células citolíticas naturales, en la actualidad no se sabe si las células dendríticas derivan de un precursor común o pueden funcionar todas como CPA de la misma manera. Las células dendríticas son las CPA más potentes del sistema inmunitario capaces de estimular respuestas primarias de linfocitos T y B. (Banchereau y col., Nature 392: 245-252 (1998) ) .

Estudios han descrito procedimientos para el aislamiento y la expansión de CD humanas a partir de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para promover el procesamiento de un antígeno por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de clase I por medio de células dendríticas (CD) humanas, en el que dichas CD se exponen in vitro a un antígeno asociado con una célula tumoral en presencia del bacilo de Calmette Guerin (BCG) o BCG con lipopolisacárido (LPS) como factor o agente que promueve el procesamiento del antígeno por el CMH de clase I.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el antígeno es un lisado de células tumorales aisladas de un paciente, un antígeno purificado asociado al tumor, un antígeno purificado asociado al tejido o un fragmento antigénico de los mismos.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el antígeno es un antígeno asociado al tumor de próstata.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el antígeno asociado al tumor de próstata es el antígeno prostático específico de membrana purificado (PSMA) .

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las CD humanas se obtienen de la piel, el bazo, la médula ósea, el timo, los ganglios linfáticos, la sangre de cordón umbilical o la sangre periférica.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células dendríticas son células 15 dendríticas con vida útil ampliada.

7. Un procedimiento para producir células T activadas in vitro que implica: a) proporcionar CD aisladas a las que se ha añadido

- BCG en una concentración de 1 x 106 unidades/ml para alcanzar una dilución seleccionada del grupo que consiste en 1:250, 1:2500 y 1:25000, y

- un antígeno asociado con una célula tumoral, y b) poner en contacto las células T in vitro con dichas CD.