Uso de un dispositivo de filtración de flujo tangencial y métodos para el enriquecimiento de leucocitos.

Un método para la separación de leucocitos en una muestra de componentes sanguíneos de un sujeto,

retirando los componentes sanguíneos no leucocitarios, tales como plasma, plaquetas y eritrocitos, donde la muestra comprende leucocitos. El método consiste en:

i) introducir la muestra de componentes sanguíneos que comprende leucocitos en un dispositivo de filtración de flujo tangencial que consta de: una unidad colectora (1) que dispone de una cámara cilíndrica de flujo cruzado (3), una cámara de filtrado (4) y un filtro (5) dispuesto entre ellas, de forma que el filtro (5) comunica el fluido de la cámara de flujo cruzado (3) con la cámara de filtrado(4); la cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) que tiene una entrada (6) y una salida (7), estando la entrada (6) dispuesta para introducir la muestra en la cámara de flujo cruzado (3) y paralela a la superficie del filtro (5), y la salida (7) ubicada frente al centro del filtro (5) y perpendicular a la superficie del filtro (5);

donde la muestra se introduce en la cámara de flujo cruzado a un índice de entrada de entre 5 y 100 veces el índice de filtración y la muestra fluye en remolino en la cámara de flujo cruzado;

el filtro (5) tiene un diámetro sustancialmente igual al diámetro de la cámara de flujo cruzado, un tamaño de poro medio de 3 a 7 micrones, siendo la variabilidad del tamaño del poro +/-20%;

ii) someter la muestra a un flujo cruzado sustancialmente paralelo alfiltro (5);

iii) someter el fluido a filtración a través del filtro (5); y

iv) retirar de forma selectiva los componentes sanguíneos no leucocitarios de la muestra, a fin de formar una población de células enriquecida en leucocitos.

Uso de un dispositivo de filtración de flujo tangencial y métodos para el enriquecimiento de leucocitos.

Antecedentes de la invención A menudo las poblaciones de células sanguíneas enriquecidas en leucocitos resultan recomendables para su uso en la investigación o terapia. Entre las fuentes típicas de leucocitos se incluyen la sangre periférica completa, el 5 producto de la leucoféresis o aféresis, u otras fuentes menos comunes, tales como la sangre del cordón umbilical. El enriquecimiento de leucocitos se puede realizar de varias maneras. Entre los métodos típicos se incluyen los gradientes de densidad (por ejemplo, FICOLL-HYPAQUE®, sílice coloidal y similares) , elutriación, centrifugación, lisis de eritrocitos mediante choque hipotónico y diversas combinaciones de estos métodos. Cada uno de estos métodos ofrece desventajas, siendo una de ellas la necesidad de unos laboriosos pasos de lavado tras la etapa de 10 enriquecimiento.

Tras el enriquecimiento, las células se lavan típicamente mediante un proceso repetitivo. Por lo general, los pasos implican la colocación de la suspensión de células enriquecidas en un tubo centrífugo y provocar un proceso de granulación de las células en el fondo del tubo utilizando una centrifugadora. El tubo se retira de la centrifugadora y el sobrenadante se decanta separándolo de los gránulos de células. Se añade un líquido de lavado al tubo y los 15 gránulos de células son resuspendidos. Típicamente estos pasos se repiten entre 2 y 4 veces.

Una desventaja de este proceso de lavado es que la resuspensión secuencial y la centrifugación pueden mermar la viabilidad de las células y potenciar su lisis. Otra desventaja del lavado mediante centrifugación es la oportunidad de que las bacterias u otros agentes infecciosos contaminen las células. Aún cuando todos los materiales se mantengan en condiciones estériles, la apertura repetida de los tubos centrífugos y la exposición al aire de las 20 pipetas y las botellas de la solución de lavado puede provocar contaminación. El riesgo de contaminación es lo suficientemente importante como para que algunos organismos reguladores médicos exijan que solamente se utilicen sistemas "cerrados" para la manipulación de las células.

También se han utilizado métodos de filtración para retirar los leucocitos de la sangre, conservando al mismo tiempo otros componentes sanguíneos para su posterior uso. Por lo general, estos métodos atrapan los leucocitos sobre un 25 filtro de forma no recuperable, al tiempo que se permite que otros componentes pasen a través del filtro, recogiéndose en un recipiente. Por ejemplo, existen filtros para retirar los leucocitos de la sangre, a fin de minimizar la incidencia de las reacciones aloinmunes tras una transfusión de sangre. Típicamente esto se consigue utilizando filtros fabricados en malla de fibra de plástico mateado. Por lo general, la malla mantiene una disposición apropiada para atrapar los leucocitos en una matriz reticulada con una profundidad suficiente para que las células queden 30 atrapadas por toda la profundidad del filtro, evitando de este modo que el filtro se obstruya, tal y como ocurriría si los leucocitos fuesen atrapados sobre una superficie plana.

El documento WO98/13131 divulga un método para separar los eritrocitos en sangre completa de los leucocitos, utilizando un dispositivo TFF.

Además de atrapar físicamente las células, los materiales y la gran superficie del filtro permiten que los leucocitos se 35 adhieran de forma irreversible a la superficie. Muchas de estas células adherentes son precisamente las que se buscan para algunos procedimientos médicos. La combinación resultante de atrapamiento y adherencia al filtro crea un método altamente eficaz para retirar los leucocitos a desechar antes de la terapia de infusión de sangre. Sin embargo, cuando los leucocitos son las células buscadas, este método de filtración no resulta ventajoso.

Un método que ha resultado útil para el fraccionamiento de diversas partículas es la filtración de flujo tangencial 40 (TFF) o filtración de "flujo cruzado". La TFF se basa en el movimiento de un fluido paralelo a la superficie de un filtro de membrana porosa. Los poros de la membrana permiten el paso del fluido y de las partículas que se encuentran en el fluido y que son más pequeñas que los poros. Por otra parte, el flujo cruzado (o flujo "tangencial") de fluido paralelo al filtro evita la acumulación de partículas mayores que los poros sobre la superficie del filtro.

La TFF se ha utilizado para la separación en bruto de diversos materiales. El uso de la filtración de flujo tangencial 45 en el campo farmacéutico ha sido revisado por Genovesi (J. Parenter. Aci. Technol., 37:81, 1983) , incluyendo la filtración de agua estéril para la inyección, clarificación de un sistema de solvente y filtración de enzimas de caldos y cultivos bacterianos. Marinaccio et al. (WO 85/03011) documenta un proceso para su uso en la extracción de la sangre de componentes sanguíneos particulados para la plasmaféresis, y Robinson et al. (Patente estadounidense 5.423.738 ) describe el uso de la TFF para extraer el plasma de la sangre, permitiendo la reinfusión de células 50 sanguíneas y plaquetas en los pacientes.

En otro uso, se ha documentado la TFF para la filtración de cerveza (EP 0 208 450) , concretamente para extraer partículas como las células de levadura y otros sólidos suspendidos. Kothe et al. (Patente estadounidense 4.644.056) divulga el uso de la TFF en la purificación de inmunoglobulinas de la leche o el calostro, y Castino (Patente USA 4.420.398) describe su uso en la separación de sustancias antivirales, tales como interferones, de los 55 caldos que contienen estas sustancias, así como células y partículas virales. De forma similar, la TFF se ha utilizado en la separación de enzimas bacterianas de los restos de células. (Quirk et al., Enzyme Microb. Technol, 6:201, 1984) Por otra parte, las unidades de filtración de flujo tangencial se han empleado en la concentración de células suspendidas en medios de cultivo (véase, por ejemplo, Radlett, J. Appl. Chem. Biotechnol., 22:495, 1972) .

Recientemente, también se ha documentado el uso de la TFF para separar liposomas y partículas de lípidos en función de su tamaño. (Lenk et al., Patente USA 5.948.441.) La TFF permite la formación y el aislamiento de liposomas y partículas de lípidos con un rango de tamaño definido de poblaciones heterogéneas de tales partículas. (Véase Lenk et al., supra) .

Sin embargo, a pesar de que la TFF se ha utilizado para el fraccionamiento en bruto de líquidos biológicos y la 5 separación, por ejemplo, de liposomas, el uso de la TFF para la separación de diferentes poblaciones de células vivas que presentan unas características definidas no se ha apreciado en la técnica. En particular, no se han abordado los problemas únicos asociados con la separación selectiva de poblaciones de leucocitos (tales como monocitos, células precursoras y células madre hematopoyéticas CD34+ o similares) de otras células sanguíneas, manteniendo la esterilidad, la viabilidad de las células, el potencial hematopoyético para diferenciarse y la actividad 10 celular inmunoterapéutica. Por otra parte, los enfoques actuales no han resuelto la extracción de otras poblaciones de células, como poblaciones con rangos de tamaño que se solapan.

Por tanto, sigue existiendo una necesidad en la técnica de dispositivos y métodos adicionales para el enriquecimiento selectivo de leucocitos respecto de otros componentes de la sangre, incluyendo plasma, eritrocitos y/o plaquetas, preservando al mismo tiempo la esterilidad, la viabilidad de las células, el potencial para diferenciarse 15 y la actividad celular inmunoterapéutica. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

Breve resumen de la invención La presente invención se refiere a la separación de leucocitos de la sangre y preparados sanguíneos conforme a las reivindicaciones. En particular, se prepara una población de células enriquecida en leucocitos mediante el uso de un dispositivo de filtración de flujo tangencial, conforme a la reivindicación 7. Se proporcionan métodos para el uso del 20 dispositivo en la preparación de poblaciones enriquecidas en leucocitos y poblaciones de células enriquecidas en monocitos, células precursoras y células madre CD34+ hematopoyéticas y similares. Las poblaciones de células enriquecidas en leucocitos y/o monocitos y similares obtenidas mediante el uso de los dispositivos y métodos de la presente invención se pueden utilizar para preparar composiciones de células presentadoras de antígenos, como células dendríticas presentadoras de antígenos, para la administración... [Seguir leyendo]

1. Un método para la separación de leucocitos en una muestra de componentes sanguíneos de un sujeto, retirando los componentes sanguíneos no leucocitarios, tales como plasma, plaquetas y eritrocitos, donde la muestra comprende leucocitos. El método consiste en:

i) introducir la muestra de componentes sanguíneos que comprende leucocitos en un dispositivo de 5 filtración de flujo tangencial que consta de: una unidad colectora (1) que dispone de una cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) , una cámara de filtrado (4) y un filtro (5) dispuesto entre ellas, de forma que el filtro (5) comunica el fluido de la cámara de flujo cruzado (3) con la cámara de filtrado (4) ;

la cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) que tiene una entrada (6) y una salida (7) , estando la entrada (6) dispuesta para introducir la muestra en la cámara de flujo cruzado (3) y paralela a la superficie del filtro (5) , y la salida (7) 10 ubicada frente al centro del filtro (5) y perpendicular a la superficie del filtro (5) ;

donde la muestra se introduce en la cámara de flujo cruzado a un índice de entrada de entre 5 y 100 veces el índice de filtración y la muestra fluye en remolino en la cámara de flujo cruzado;

el filtro (5) tiene un diámetro sustancialmente igual al diámetro de la cámara de flujo cruzado, un tamaño de poro medio de 3 a 7 micrones, siendo la variabilidad del tamaño del poro +/-20%; 15

ii) someter la muestra a un flujo cruzado sustancialmente paralelo alfiltro (5) ;

iii) someter el fluido a filtración a través del filtro (5) ; y iv) retirar de forma selectiva los componentes sanguíneos no leucocitarios de la muestra, a fin de formar una población de células enriquecida en leucocitos.

2. El método conforme a la reivindicación 1, que comprende también: 20

preparar la muestra del sujeto mediante leucoféresis, centrifugación por densidad, lisis diferencial, filtración o preparación de una capa leucocitaria para su introducción en la unidad colectora (1) .

3. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende también la repetición de los pasos i) , ii) y iii) al menos dos veces para formar una población de células enriquecida en leucocitos.

4. Un método para enriquecer una muestra de componentes de sangre en monocitos, que consiste en: 25

1) introducir la muestra de componentes sanguíneos que contiene leucocitos en el dispositivo de filtración de flujo tangencial (TFF) , que se compone de: una unidad colectora (1) que dispone de una cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) , una cámara de filtrado (4) y un filtro (5) dispuesto entre ellas, de forma que el filtro (5) comunica el fluido de la cámara de flujo cruzado (3) con la cámara de filtrado (4) ;

la cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) que tiene una entrada (6) y una salida (7) , estando la entrada (6) dispuesta 30 para introducir la muestra en la cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) y paralela a la superficie del filtro (5) , y la salida (7) ubicada frente al centro del filtro (5) y perpendicular a la superficie del filtro (5) ;

el filtro (5) tiene un diámetro sustancialmente igual al diámetro de la cámara de flujo cruzado, un tamaño de poro medio de 3 a 7 micrones, siendo la variabilidad del tamaño del poro +/-20%;

(2) recircular la muestra a través de la unidad de TFF a un índice de entrada predeterminado y un índice de 35 filtración predeterminado, donde el índice de entrada es de entre 5 y 100 veces el índice de filtración y la muestra fluye en remolino en la cámara de flujo cruzado; y

(3) aislar una población de células enriquecida en monocitos para retirar los componentes sanguíneos no monocitarios, tales como plasma, plaquetas, linfocitos y eritrocitos.

5. El método conforme a la reivindicación 4, donde los monocitos son cultivados con citoquinas que 40 promueven la diferenciación de los monocitos en células dendríticas.

6. El método conforme a la reivindicación 4, donde las citoquinas son GM-CSF, o GM-CSF y IL-4.

7. El uso de un dispositivo de filtración de flujo tangencial para preparar una población de células enriquecida en leucocitos, retirando de forma selectiva los componentes sanguíneos, tales como plasma, plaquetas y eritrocitos.

el dispositivo comprende: una unidad colectora (1) que dispone de una cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) , una 45 cámara de filtrado (4) y un filtro (5) dispuesto entre ellas, de forma que el filtro (5) comunica el fluido de la cámara de flujo cruzado (3) con la cámara de filtrado (4) ;

la cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) dispone de una entrada (6) y una salida (7) , estando la entrada

(6) dispuesta para introducir una muestra de componentes sanguíneos que contiene leucocitos en la cámara cilíndrica de flujo cruzado (3) y paralela a la superficie del filtro (5) , y la salida 50

(7) ubicada frente al centro del filtro (5) y perpendicular a la superficie del filtro (5) ;

el filtro (5) tiene un diámetro sustancialmente igual al diámetro de la cámara de flujo cruzado, un tamaño de poro medio de 3 a 7 micrones, siendo la variabilidad del tamaño del poro +/-20%; de forma que el flujo de la muestra a través del filtro (5) enriquece la muestra de componentes sanguíneos en leucocitos.

medios para obtener un índice de entrada predeterminado de la muestra en la entrada de la cámara de flujo cruzado 5 y un medio para controlar un índice de filtración del filtrado a través del filtro y hacia la cámara de filtrado;

donde la muestra se introduce en la cámara cilíndrica de flujo cruzado a un índice de entrada de entre 5 y 100 veces el índice de filtración y la muestra fluye en remolino en la cámara de flujo cruzado.

8. El uso conforme a la reivindicación 7, que comprende asimismo:

una unidad de recuperación (2) que comprende una entrada (10) y una salida (11) , estando la cámara cilíndrica de 10 flujo cruzado (3) y la unidad de recuperación (2) interconectadas en forma de bucle, donde la entrada de la cámara de flujo cruzado (6) comunica el fluido con la salida de la unidad de recuperación (11) , y la salida de la cámara de flujo cruzado (7) comunica el fluido con la entrada de la unidad de recuperación (10) .

9. El uso conforme a la reivindicación 8, donde la unidad de recuperación comprende también una entrada de la muestra (12) y una entrada de lavado (13) . 15

10. El uso conforme a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde el dispositivo comprende también un aparato de procesamiento celular que comunica el fluido con la unidad colectora.

11. El uso conforme a la reivindicación 10, donde el aparato de procesamiento celular comprende un medio para el cultivo de la población de células enriquecida en leucocitos.

12. El uso conforme a la reivindicación 11, que comprende también un recipiente de cultivo de tejido graduable, 20 adaptado para recibir en condiciones asépticas los precursores de las células dendríticas monocíticas.

13. El uso conforme a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que comprende asimismo:

un medio de control de temperatura para mantener el sustrato a una temperatura predeterminada.

14. El uso conforme a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, que comprende asimismo:

una fuente de componentes sanguíneos que comunica el fluido con la entrada de la cámara de flujo cruzado. 25