Artículos que tienen moléculas localizadas dispuestas sobre ellos y métodos de producción de los mismos.

Un método de proporcionar un sustrato que tiene una enzima inmovilizada selectivamente sobre él,

comprendiendoel método:

proporcionar un sustrato que tiene un primer componente de la superficie que comprende SiO2 y un segundocomponente de la superficie que comprende un metal u óxido metálico;

poner en contacto el sustrato con una primera composición que se asocia selectivamente con el primer componentede la superficie, comprendiendo dicha primera composición un silano;

acoplar la enzima a la primera composición; y

poner en contacto el sustrato con una segunda composición que se asocia selectivamente con el segundocomponente de la superficie, comprendiendo dicha segunda composición un compuesto que comprende uno o másgrupos ácido fosfónico o fosfato.

Artículos que tienen moléculas localizadas dispuestas sobre ellos y métodos de producción de los mismos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos de producción de sustratos que tienen regiones químicas activas seleccionadas por empleo de elementos de los sustratos para ayudar a la localización de grupos químicos activos en regiones deseadas de sustrato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe una extensa gama de operaciones analíticas que pueden beneficiarse de la aptitud para analizar la reacción de moléculas individuales, números relativamente pequeños de moléculas, o moléculas a concentraciones relativamente bajas. Se han descrito varios métodos para proporcionar estas mixturas de reacción poco concentradas. Por ejemplo, en el campo de la determinación de la secuencias de los ácidos nucleicos, varios investigadores han propuesto enfoques de moléculas sencillas o de baja concentración para obtener información de secuencia en asociación con la síntesis de ácidos nucleicos dependiente del molde por la acción de enzimas polimerasa.

Los diversos enfoques diferentes para estas tecnologías de secuenciación ofrecen diferentes métodos de monitorización solamente de una o un pequeño número de reacciones de síntesis al mismo tiempo. Por ejemplo, en algunos casos, la mixtura de reacción se divide en gotitas que incluyen bajas concentraciones de sustancias reaccionantes. En otras aplicaciones, se inmovilizan ciertos reactivos sobre superficies de tal modo que los mismos pueden monitorizarse sin interferencia de otros componentes de la reacción en solución. En otro enfoque adicional, se utilizan técnicas de confinamiento óptico para establecer la información de señales únicamente de un número relativamente pequeño de reacciones, v.g. una sola molécula, dentro de un área confinada ópticamente. A pesar de la disponibilidad de las técnicas arriba descritas, existen casos en los cuales sería deseable una selectividad adicional de los componentes de la reacción para su análisis. La presente invención satisface éstas y una diversidad de necesidades.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención aporta en general métodos de proporcionar modificaciones funcionales de superficies, v.g. grupos químicos activos, en regiones seleccionadas de sustratos, así como los sustratos resultantes producidos de este modo, y el uso de dichos sustratos.

De acuerdo con ello, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para proporcionar un sustrato que tiene una enzima inmovilizada selectivamente sobre él, comprendiendo el método:

proporcionar un sustrato que tiene un primer componente de la superficie que comprende SiO2 y un segundo componente de la superficie que comprende un metal u óxido metálico;

poner en contacto el sustrato con una primera composición que se asocia selectivamente con el primer componente de la superficie, comprendiendo dicha primera composición un silano;

acoplar la enzima a la primera composición; y poner en contacto el sustrato con una segunda composición que se asocia selectivamente con el segundo componente de la superficie, comprendiendo dicha segunda composición un compuesto que comprende uno o más grupos ácido fosfónico o fosfato.

Las moléculas deseadas que se inmovilizan selectivamente pueden ser esencialmente moléculas cualesquiera, por ejemplo, moléculas activas tales como enzimas (v.g., polimerasas de ácido nucleico) o moléculas que comprenden restos de fijación o acoplamiento (v.g., moléculas de biotina) que pueden emplearse a su vez para inmovilizar otras moléculas.

Como se indica en las reivindicaciones, la presente invención proporciona métodos de inmovilización selectiva de una molécula de interés sobre un sustrato. Los métodos comprenden proporcionar un sustrato que tiene un primer componente de la superficie y un segundo componente de la superficie en donde el primer y el segundo componente de la superficie tienen características superficiales diferentes, y acoplar selectivamente la molécula de interés al primer componente de la superficie, basándose en una diferencia entre las características de superficie del primer componente de la superficie y las características de superficie del segundo componente de la superficie.

En una clase de realizaciones, las características superficiales diferentes comprenden carga superficial o interacciones electrostáticas en la superficie. Por ejemplo, el primer componente de la superficie puede tener o adquirir una carga superficial negativa y el segundo componente de la superficie una carga superficial positiva (o viceversa) . Como otro ejemplo, los componentes de superficie pueden tener características de quimisorción superficial diferentes; por ejemplo, el segundo componente de la superficie puede tener afinidad química fuerte para un grupo particular (v.g. grupos fosfonato o fosfato) , mientras que el primer componente de la superficie no tiene afinidad fuerte para dicho grupo.

Los métodos pueden emplearse para inmovilizar selectivamente moléculas de interés, v.g. en un ZMW u otro sustrato híbrido. Así, por ejemplo, el sustrato comprende opcionalmente una capa del segundo componente de la superficie sobre una capa del primer componente de la superficie, con un guiaondas en modo cero dispuesto a través de la segunda capa de componente de la superficie hasta la capa del primer componente de la superficie. En tales realizaciones (entre otras) , el primer componente de la superficie puede comprender SiO2 y/o el segundo componente de la superficie puede comprender un metal u óxido metálico (v.g., aluminio u óxido de aluminio) . En realizaciones en las cuales el sustrato híbrido está en contacto con una solución, el sustrato puede comprender un primer componente de la superficie que es un material con un punto de carga cero por debajo del pH de la solución (v.g. SiO2 a pH > 2) y/o un segundo componente de la superficie que comprende un óxido metálico con un punto de carga cero por encima del pH de la solución (v.g. óxido de aluminio a pH < 8; otros óxidos metálicos que están cargados positivamente a pH neutro incluyen, pero sin carácter limitante, óxido de talio, óxido de hierro, óxido de itrio, óxido de cinc, óxido de lantano, y óxido de magnesio) .

En ciertas realizaciones, la molécula de interés se asocia preferentemente al primer componente de la superficie. Por ejemplo, las moléculas de polimerasa cargadas positivamente se asocian preferentemente con silicato cargado negativamente sobre superficies metálicas cargadas positivamente. En otras realizaciones, el sustrato está en contacto con una primera composición que se asocia selectivamente con el primer componente de la superficie basándose en la diferencia entre las características de superficie de los componentes de superficie primero y segundo. La primera composición puede servir para una función de bloqueo, o puede asociarse, directa o indirectamente, con la molécula de interés. Así, por ejemplo, en una clase de realizaciones, la primera composición comprende un primer grupo de acoplamiento, y el acoplamiento selectivo de la molécula de interés al primer componente de la superficie comprende el acoplamiento de la molécula de interés al primer grupo de acoplamiento (v.g., un grupo funcional químico, un grupo de fijación tal como biotina, o análogos) .

En una clase de realizaciones, la primera composición comprende un silano, v.g., para asociación selectiva con un primer componente de la superficie de silicato. Silanos ilustrativos incluyen, pero sin carácter limitante, biotina-PEGsilanos. En otra clase de realizaciones, la primera composición comprende un fosfolípido. En otra clase adicional de realizaciones, la primera composición comprende polilisina-PEG o polilisina-PEG-biotina.

Los métodos incluyen opcionalmente poner en contacto el sustrato con una segunda composición que se asocia selectivamente con el segundo componente de la superficie basándose en la diferencia entre las características de superficie de los componentes de superficie primero y segundo. El tratamiento con la segunda composición se realiza opcionalmente antes o después del acoplamiento de la molécula de interés al primer componente de la superficie, incluyendo antes o después del tratamiento con cualquier primera composición. En algunas realizaciones, la segunda composición comprende un segundo grupo de acoplamiento, típicamente diferente de cualquier primer grupo de acoplamiento. Segundas composiciones ilustrativas incluyen, v.g., polielectrólitos... [Seguir leyendo]

1. Un método de proporcionar un sustrato que tiene una enzima inmovilizada selectivamente sobre él, comprendiendo el método: proporcionar un sustrato que tiene un primer componente de la superficie que comprende SiO2 y un segundo 5 componente de la superficie que comprende un metal u óxido metálico; poner en contacto el sustrato con una primera composición que se asocia selectivamente con el primer com

ponente de la superficie, comprendiendo dicha primera composición un silano;

acoplar la enzima a la primera composición; y poner en contacto el sustrato con una segunda composición que se asocia selectivamente con el segundo componente de la superficie, comprendiendo dicha segunda composición un compuesto que comprende uno o más grupos ácido fosfónico o fosfato, 2. El método de la reivindicación 1, en el cual el sustrato comprende una capa del segundo componente de la superficie sobre una capa del primer componente de la superficie, y en donde el sustrato comprende un guiaondas en modo cero dispuesto a través de la capa del segundo componente de la superficie hasta la primera capa del componente de la superficie.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual la primera composición comprende un primer grupo de acopla

miento, y en donde el acoplamiento de la enzima a la primera composición comprende acoplamiento de la enzima al 20 primer grupo de acoplamiento.

4. El método de la reivindicación 3, en el cual el primer grupo de acoplamiento comprende biotina.

5. El método de la reivindicación 1, en el cual la primera composición comprende un biotina-PEG-silano. 25

6. El método de la reivindicación 1, en el cual la segunda composición comprende ácido polivinilfosfónico, ácido 2-carboxietil-fosfónico, ácido amino-tri (metilenofosfónico) , ácido 1-hidroxietilideno-1, 1-difosfónico, ácido hexametilenodiaminatetra (metilenofosfónico) , ácido dietilenotriamina-penta (metilenofosfónico) , ácido etilenodiaminatetra (metileno-fosfónico) , ácido bis (hexametileno-triamina-penta (metilenofosfónico) ) , ácido 2-fosfonobutano-1, 2, 4

tricarboxílico, difosfonato de monoetanolamina, un alquil-fosfato, un alquil-fosfonato, ácido octil-fosfónico, ácido decil-fosfónico, ácido dodecil-fosfónico, ácido hexadecil-fosfónico, ácido octadecil-fosfónico, ácido docosil-fosfónico, ácido hidroxi-dodecil-fosfónico, ácido hidroxi-undecenil-fosfónico, ácido decanodiilbis (fosfónico) , dodecilfosfato, hidroxi-dodecilfosfato, o

35 7. El método de la reivindicación 1, en el cual la segunda composición comprende un segundo grupo de acoplamiento.

8. El método de la reivindicación 1, en el cual la enzima comprende una polimerasa.

40 9. El método de la reivindicación 1, en el cual el sustrato se pone en contacto con la segunda composición y se pone a continuación en contacto con la primera composición.

10. Un método que comprende, tras haber producido un sustrato por el método de la reivindicación 2, el paso adicional de emplear el sustrato para un análisis enzimático proporcionando iluminación a y recibiendo radiación 45 electromagnética desde un volumen de observación del guiaondas en modo cero a través de la primera capa del componente de la superficie.

11. Un sistema, que comprende un sustrato producido por el método de la reivindicación 2, en el que el sistema proporciona iluminación a y deriva radiación electromagnética desde un volumen de observación del guiaondas en modo cero a través de la primera capa del componente de la superficie.

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