Aparato para el bloqueo de los ácidos nucleicos mediante fotoactivación de agentes intercalantes.

Comprende:

- una carcasa (1) con una pared superior (1a) con uno o más orificios pasantes (2), previstos para insertar a su través uno o más de tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), cada uno de los cuales contiene una respectiva muestra (M) que incluye unos ácidos nucleicos y unos agentes intercalantes fotosensibles mezclados en forma líquida, y

- uno o más LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) montados en el interior de la carcasa (1) de manera que emiten luz, según una o más direcciones determinadas, hacia unas respectivas partes (3a, 3b y 3c) de dichos de tubos (3), para realizar fotoactivación de los agentes intercalantes con el fin de unirlos covalentemente a los ácidos nucleicos libres o accesibles.

Aparato para el bloqueo de los ácidos nucleicos mediante fotoactivación de agentes intercalantes.

Sector de la técnica

La presente invención concierne a un aparato para el bloqueo de los ácidos nucleicos mediante fotoactivación de agentes intercalantes utilizando diodos emisores de luz, LEDs, y más particularmente a un aparato que comprende un alojamiento en el que insertar uno o más tubos de ensayo o de microcentrífuga conteniendo unas respectivas muestras mezcladas con unos agentes intercalantes en forma líquida, y en el interior del cual se encuentran montados uno o más LEDs que emiten luz hacia dicho o dichos tubos.

La presente invención se enmarca en el campo correspondiente a equipos para técnicas de biología molecular para el estudio de ácidos nucleicos.

Estado de la técnica anterior

En las técnicas de biología molecular basadas en la detección de ácidos nucleicos, tanto en el campo del diagnóstico como en el de la microbiología ambiental, el control de calidad de la industria alimentaria, la industria farmacéutica y homologas, la posibilidad de poder diferenciar entre células o virus viables (infectivos o con poder patogénico) es muy importante. En todas las matrices, tanto en muestras clínicas como en ambientales, en productos naturales o manufacturados, existen ácidos nucleicos de organismos muertos y ácidos nucleicos de organismos vivos. En todos estos ámbitos las técnicas basadas en la detección de ácidos nucleicos son de especial relevancia porque permiten una detección mucho más rápida que la mayoría de métodos existentes e incluso en algunos casos (por ejemplo detección de virus) son prácticamente la única posibilidad.

Hasta hace unos años todas las técnicas analíticas basadas en el estudio de ácidos nucleicos se basaban en el estudio de ácidos nucleicos totales (DNA o RNA) que incluían tanto el de organismos vivos como el de muertos. Esta detección no selectiva podía condicionar la aplicabilidad de técnicas basadas en la amplificación de DNA, en sectores como el control de calidad o diagnóstico, y restringir su uso.

En la actualidad una nueva familia de métodos basados en la neutralización de los ácidos nucleicos libres o accesibles (que se entiende corresponden a organismos muertos) con agentes intercalantes fotoactivables ha solventado el problema. Bajo unas condiciones determinadas de exposición lumínica estos agentes se fotoactivan de manera que se unen covalentemente a los ácidos nucleicos de modo que los invalida como diana de detección.

En la actualidad se ha demostrado que mediante el uso, como agentes intercalantes fotoactivables, de determinadas azidas como el PMA (Propidium monoazide) y el EMA (Ethidium monoazide) es posible neutralizar los ácidos nucleicos de las células muertas cuando se expone la mezcla de reacción a lámparas halógenas de alto voltaje (Nogva et al., 2003; Rudi et al., 2005; Nocker, A., et al 2006; Pisz et al., 2007; Vesper et al., 2008). Bajo las mismas condiciones estudios aún más recientes demuestran que el PMA es una opción más válida que el EMA (Nocker et al, 2006; Flekna et al, 2007).

Con independencia de la selección del agente intercalante, en la actualidad en la mayoría de casos el tratamiento consiste en una corta exposición, de 2 a 5 minutos, a una lámpara halógena de al menos 650 vatios. Esta exposición resulta crítica debido a que causa un importante calentamiento de la muestra que obliga a trabajar con algún sistema de refrigeración de la muestras con el objetivo de evitar daños sobre la misma. Hasta ahora esta refrigeración consiste en pre-enfriar la muestra y utilizar baños de hielo. Todo ello resulta en que para cargas de trabajo importantes el procedimiento resulte laborioso, el control de temperatura no siempre sea constante y aumenta el riesgo de contaminación de la muestra al estar el tubo que la contiene en contacto con una masa de agua-hielo no estériles. En la actualidad los profesionales que trabajan con este tipo de técnicas lo hacen con montajes particulares no basados en equipos comerciales.

Por otro lado, es bien conocido que este tipo de agentes intercalantes únicamente se fotoactivan con la luz comprendida entre 400-500 nm (Bolton, P.H., and Kearns, D.R., 1978), que es una fracción muy pequeña del espectro de emisión de las lámparas halógenas usadas en la actualidad. Por lo que el proceso de fotoactivación es por sí mismo muy ineficiente.

Es por todo ello que son necesarios equipos comerciales en los que se pueda trabajar bajo condiciones estándares de exposición, mínimo efecto térmico y con sistemas de iluminación más eficientes.

El bloqueo de ácidos nucleicos mediante el uso de agentes intercalantes fotosensibles es una tecnología en pleno desarrollo. En la actualidad existen pocas experiencias publicadas y básicamente desarrolladas para bacterias, a pesar que en teoría pueden ser aplicadas a todo tipo de microorganismos como bacterias, arqueas, virus, protozoos y otras estructuras como los huevos de nemátodos. Y no sólo se deben considerar los microorganismos, sino también el tipo de muestras ambientales (aguas, suelo, alimentos) y muestras clínicas. Por lo que es improbable que exista un único protocolo de tratamiento. En microbiología convencional y molecular hasta ahora es así, por lo que se estima que el uso de agentes como el PMA requerirá de protocolos adaptados y desarrollados para cada tipología de muestra y microorganismo.

La reacción de fotoactivación depende de la concentración del reactivo y de la dosis de luz (que es función del tiempo y potencia). Por otro lado la reacción se debe llevar a cabo en condiciones térmicas que no adulteren el objeto del ensayo. Por ejemplo para microorganismos psicrófilos se debe minimizar el incremento de temperatura, y en general para todas las muestras biológicas se requieren unas condiciones isotérmicas que garanticen estabilidad y homogeneidad.

En condiciones de pH cercanas a la neutralidad, y para el PMA, el máximo de absorción está en 470 nm y dicha absorción presenta una curva de reducida amplitud, por lo que encaja perfectamente con los espectros de emisión de algunos modelos de LEDS que emiten luz azul. En la actualidad existen LEDS que permiten cubrir de manera no continua buena parte del espectro visible, e incluso del ultra violeta. Por lo que para procesos foto-bioquímicos de laboratorio y a escala industrial, suelen ser la opción más lógica, por la calidad de la luz y por su eficiencia en el rendimiento.

En la solicitud WO2009055810-A1 se describe una propuesta que contempla llevar a cabo la mencionada fotoactivación mediante luz azul, en particular utilizando LEDs. En dicha solicitud se describe un discriminador de microorganismos que comprende una carcasa para incubar a la muestra en bajas condiciones de iluminación, que incluye un inyector dispuesto en la carcasa para suministrar los agentes intercalantes (por ejemplo PMA) a la muestra, y un iluminador para emitir luz azul hacia la muestra. Aunque dicha solicitud incluye una reivindicación independiente en la que no se incluye a una base para transportar a la muestra entre la carcasa y el iluminador, y viceversa, en todas las realizaciones descritas el discriminador de microorganismos de WO2009055810-A1 comprende dicha base, ya que la carcasa incubadora y el iluminador son dos unidades separadas. No se propone en dicha solicitud implementar todo el proceso de fotoactivación en un único aparato, ni aplicarlo sobre unas muestras mezcladas en forma líquida con los agentes intercalantes en unos tubos de ensayo o de microcentrífuga.

La mayoría de procedimientos de ensayo en microbiología cursan con diferentes pasos, muchos de los cuales están basados en la dosificación de reactivos líquidos, y el mismo procesado de las muestras es mediante disolución en soluciones isotónicas. En este escenario, la mayoría de ensayos publicados, a excepción del descrito por Vesper et al, 2008 en "Quanti- fying fungal viability in air and water samples using quantitative PCR after treatment with propidium monoazide (PMA)", J. Microbiol. Methods. 72, 180-184, asociado a la solicitud WO2009055810-A1, se basan en el procesado de las muestras y la dosificación del PMA en líquido y en tubos de microcentrífuga, aunque no mediante LEDs. Por ello se estima como más apropiado que un equipo que tenga como objeto este tipo de ensayos tenga como soporte de trabajo tubos de microcentrífuga.

Explicación de la invención

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1. Aparato para el bloqueo de los ácidos nucleicos mediante fotoactivación de agentes intercalantes, del tipo que comprende:

- una carcasa (1) para alojar al menos una muestra (M) que incluye unos ácidos nucleicos y unos agentes intercalantes fotosensibles,

- al menos un diodo emisor de luz (L1, L2, L3, L10, L20, L30), LED, dispuesto para emitir luz hacia dicha muestra (M), que es al menos una, para realizar la fotoactivación de dichos agentes intercalantes con el fin de unirlos covalentemente a al menos parte de dichos ácidos nucleicos,

estando caracterizado dicho aparato porque dicha carcasa (1) comprende al menos una pared (1a) con al menos un orificio pasante (2) previsto para insertar a su través, al menos en parte, un tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) que contiene a dicha muestra (M) y a dichos agentes intercalantes mezclados en forma líquida, y porque dicho LED (L1, L2, L3, L10, L20, L30), que es al menos uno, está montado en el interior de dicha carcasa (1) dispuesto con relación a dicho orificio pasante (2), que es al menos uno, de manera que cuando dicho tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) se encuentra insertado a su través dicho LED (L1, L2, L3, L10, L20, L30), que es al menos uno, está cerca del tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) y emite luz, en una dirección determinada, hacia una región interior de la carcasa (1) que está ocupada por parte de dicho tubo de ensayo o de microcentrífuga (3), que es al menos uno, cuando está insertado a través del orificio pasante (2), dicha parte del tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) incluyendo a dicha muestra (M) y a dichos agentes intercalantes mezclados en forma líquida.

2. Aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha pared (1a) de dicha carcasa (1) comprende una pluralidad de orificios pasantes (2) previstos para insertar a su través, al menos en parte, una correspondiente pluralidad de tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), cada uno de los cuales contiene una respectiva muestra (M) que incluye unos ácidos nucleicos y unos agentes intercalantes fotosensibles mezclados en forma líquida, y porque comprende una pluralidad de dichos LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) montados en el interior de dicha carcasa (1) de manera que emiten luz, en al menos una dirección determinada, hacia unas respectivas partes (3a) de dicha pluralidad de tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), al menos un LED por tubo, que incluyen a dichas respectivas muestras (M).

3. Aparato según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha pluralidad de LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) comprende al menos unos primeros LEDs (L1, L10), cada uno de ellos dispuesto adyacente a la punta (3a) de uno respectivo de dichos tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), para emitir luz hacia la misma en dicha dirección determinada, la cual coincide con el eje longitudinal del tubo de ensayo o de microcentrífuga (3).

4. Aparato según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha pluralidad de LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) comprende además unos segundos LEDs (L2, L20), cada uno de ellos montado en el interior de la carcasa (1) quedando dispuesto adyacente a una primera región (3b) de pared lateral de un respectivo de dichos tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), para emitir luz hacia la misma en una dirección transversal, y al menos unos terceros LEDs (L3, L30), cada uno de ellos montado en el interior de la carcasa (1) quedando dispuesto adyacente a una segunda región (3c) de pared lateral de uno respectivo de dichos tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), opuesta a dicha primera región (3b), para emitir luz hacia la misma también una dirección transversal.

5. Aparato según la reivindicación 4, caracterizado porque dichos segundos (L2, L20) y terceros (L3, L30) LEDs están dispuestos para emitir luz hacia unas regiones (3b, 3c) de pared lateral de cada tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) incluidas en el tercio longitudinal del mismo que finaliza en una respectiva de dichas puntas (3a).

6. Aparato según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un soporte (4) para dicha pluralidad de tubos de ensayo o de microcentrífuga (3), previsto para, al disponerse adyacente a dicha pared (1a) de la carcasa (1), posicionar a cada uno de los tubos de ensayo o de microcentrífuga (3) con respecto a un respectivo orificio de dicha pluralidad de orificios pasantes (2) y posibilitar su inserción/extracción con relación al mismo.

7. Aparato según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha pared (1a) es una pared superior de la carcasa (1), y porque dicho soporte (4) comprende una placa (4a) que define una correspondiente pluralidad de agujeros pasantes (5) de diámetro inferior al diámetro del contorno exterior de una zona próxima a la abertura de cada tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) o de un tapón (6) que cierra a la misma, de manera que cada uno de los tubos de ensayo o de microcentrífuga (3) queda encajado en uno de dichos agujeros pasantes (5) al atravesarlo en parte, estando dichos agujeros pasantes (5) distribuidos de igual manera que los orificios pasantes (2) de la pared superior (1a) de la carcasa (1), quedando alineados con los mismos al disponerse dicha placa (4a) adyacente sobre la zona de la pared superior (1a) de la carcasa (1) que incluye a dichos orificios pasantes (2).

8. Aparato según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha carcasa (1) es un cuerpo paralelepipédico, y porque dicho soporte (4) comprende dos paredes laterales (4b, 4c) que se extienden desde dos respectivos bordes longitudinales (b1, b2) de dicha placa (4a), adoptando el soporte (4) una sección transversal en forma de U, quedando, cuando la placa (4a) se dispone adyacente a la pared superior (1a) de la carcasa (1), cada una de dichas dos paredes laterales (4b, 4c) del soporte (4) adyacente a una región de una respectiva de dos paredes laterales mayores (1b, 1c) de la carcasa (1).

9. Aparato según la reivindicación 8, caracterizado porque la distancia de dichas paredes laterales (4b, 4c) que va desde el borde longitudinal (b1, b2) de la placa (4a) hasta su borde libre (b3, b4) opuesto a dicho borde longitudinal (b1, b2), es superior a al menos la porción longitudinal del tubo de ensayo o de microcentrífuga (3) que traspasa a dicho agujero pasante (5) de la placa (4a) del soporte (4), de manera que al apoyar al soporte (4) en una superficie plana por dichos bordes libres (b3, b4), las puntas (3a) de los tubos de ensayo o de microcentrífuga (3) no toquen a dicha superficie plana.

10. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un sistema electrónico que incluye a dichos LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) montados sobre al menos una placa de circuito impreso (P1, P2, P3, P10, P20, P30) con circuitería eléctrica/electrónica en conexión eléctrica con los mismos.

11. Aparato según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha placa de circuito impreso (P1, P2, P3, P10, P20, P30), que es al menos una, se encuentra montada sobre un elemento de soporte (S1, S2) de manera que los LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) queden a una cierta distancia de los tubos de ensayo o de microcentrífuga (3).

12. Aparato según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho sistema electrónico está previsto para controlar el funcionamiento de dichos LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30).

13. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichos LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) están configurados para emitir una luz azul en un rango de 400 a 500 nm.

14. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un sistema de ventilación formado por al menos un ventilador (7) montado en el interior de dicha carcasa (1) encarado hacia dichos LEDs (L1, L2, L3, L10, L20, L30) con el fin de refrigerarlos.

15. Aparato según la reivindicación 8, caracterizado porque dicha carcasa (1) está formada por dos piezas acoplables entre sí para formar dicho cuerpo paralelepipédico: una que comprende a dicha pared superior (1a) y a dichas paredes laterales mayores (1b, 1c), y otra que comprende una pared base (1d), opuesta a dicha pared superior (1a) cuando ambas piezas de la carcasa (1) se encuentran acopladas, y dos paredes laterales menores (1e, 1f).