Antígenos y anticuerpos novedosos asociados a adenocarcinoma ductal pancreático.

Isoforma de alfa-enolasa humana caracterizada porque está fosforilada en al menos 3 posiciones,

en la que las 3 posiciones se escogen entre Treonina 55, Tirosina 57, Tirosina 200, Tirosina 236, Treonina 237, Tirosina 257 y Serina 419.

Antígenos y anticuerpos novedosos asociados a adenocarcinoma ductal pancreático Campo de la invención La presente invención se refiere a medios novedosos para diagnosticar y tratar cánceres humanos, en particular los de origen pancreático.

Antecedentes de la invención El adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) es el cáncer pancreático más frecuente y la cuarta causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos y Europa. La mayoría de pacientes mueren en el plazo de 12 meses, y sólo el 2% sobrevive cinco años tras el diagnóstico. La pancreatectomía sigue siendo la piedra angular del manejo de PDA y la quimioterapia proporciona sólo un beneficio de supervivencia mínimo (Laheru D y Jaffee M, 2005; Kleef J et al., 2006) .

A pesar del manejo médico y quirúrgico mejorado (incluyendo el uso de anticuerpos monoclonales, vacunas y quimioterapia) , existen todavía pocos marcadores y escasamente fiables para el diagnóstico de PDA temprano. El marcador serológico más ampliamente usado para el diagnóstico de cáncer pancreático es el antígeno del grupo sanguíneo Lewis sialilado CA 19-9, pero su uso se dirige en su mayoría hacia la monitorización de la respuesta a la terapia, en lugar del diagnóstico de PDA. De hecho, este antígeno también puede estar presente en concentraciones elevadas en los sueros de pacientes afectados por enfermedades pancreáticas benignas (tales como pancreatitis crónica u obstrucción biliar) proporcionando falsos positivos, y no puede usarse en todos los casos debido a que no se expresa en absoluto en el 5-10% de la población (Okusaka T et al., 2006) .

Es por estos motivos que están en evaluación biomarcadores alternativos para su uso en el diagnóstico de PDA, con el objetivo de limitar procedimientos invasivos tales como biopsias y evaluación histopatológica (Bouvet M, 2004; Brand R, 2001; Goggins M, 2005; Leung T et al., 2005) , y para evaluar candidatos a fármacos (Cohen S y Meropol N, 2002; Jimcno A e Hidalgo M, 2006) .

Se han empleado recientemente diversas tecnologías para la identificación de biomarcadores de PDA candidatos usando análisis a gran escala de la expresión de proteínas (basándose en niveles o bien de proteína o bien de ARN) . En particular, se han usado tecnologías de proteómica para detectar antígenos que provocan una respuesta humoral en los sueros de pacientes con PDA comparando las proteínas que se resuelven por electroforesis en gel bidimensional (2-DE) , reconocidas por anticuerpos séricos de pacientes con cáncer, e identificadas usando espectrometría de masas (Gorg A et al., 2004; Graham D et al., 2005) . Se han descrito variantes de este enfoque para la separación, selección y caracterización de proteínas con nombres diferentes en la bibliografía, tal como SERPA (Klade C et al., 2001) , PROTEOMEX (Lichtenfels R et al., 2003) o SPEAR (Unwin R et al., 2003) .

La hipótesis de trabajo común para estas metodologías es que, caracterizando el repertorio de células B frente a antígenos expresados específicamente por cánceres (el denominado inmunoma de cáncer humano) , debe ser posible definir dianas específicas que están implicadas en la inmunovigilancia e inmunoedición del cáncer, y entender los mecanismos que conducen a proliferación celular no controlada y metástasis (Drake C et al., 2006; Dunn G et al., 2004) .

Se ha sugerido que la inmunoterapia puede ser un enfoque valioso para el tratamiento del cáncer pancreático (Laheru D y Jaffee M, 2005) . De hecho, se han generado listas de proteínas específicas de PDA candidatas basándose en su elevada expresión en el nivel de ARN (documento WO 04/55519) , o de análisis proteómico a gran escala de muestras de suero y/o muestras pancreáticas (Bhattachar y ya S et al., 2004; Cao D et al., 2005; Cecconi D et al., 2003; Chen R et al., 2005; Gronborg M et al., 2006; Honda K et al., 2005; Koomen J et al., 2005; Rodriguez J et al., 2005; Shen J et al., 2004, Rosty C y Goggins M, 2005; Sinha P et al., 1999; Yu Y et al., 2005) . Las proteínas candidatas para el diagnóstico de PDA en sueros son fibrinógeno gamma (Bloomston M et al., 2006) , proteína 48 DEAD-Box (Xia Q et al., 2005) , MIC-1 (Koopmann et J al., 2004) , proteína relacionada con PTH (Bouvet M et al., 2001) y calreticulina (Hong S et al., 2004) .

Se ha observado la sobreexpresión de alfa-enolasa humana en adenocarcinoma ductal pancreático humano, especulándose sobre la posibilidad de usarla en el diagnóstico y la terapia. Sin embargo, no se ha identificado ninguna isoforma específica de alfa-enolasa (Shen J et al., 2004) .

Sin embargo, todavía se necesitan biomarcadores fiables para la detección temprana de PDA y su diferenciación de otros cánceres o patologías pancreáticas.

Descripción de la invención La presente invención se basa en la observación de que sueros de pacientes con PDA, en comparación con sueros de individuos sanos o de individuos afectados por otras patologías, contienen anticuerpos dirigidos contra proteínas específicas que se expresan en una línea celular originada a partir de cánceres pancreáticos. La presencia de estas proteínas se confirmó usando anticuerpos purificados específicos para tales proteínas en extractos obtenidos a partir de tejidos pancreáticos normales y con PDA.

Un objeto principal de la presente invención son isoformas asociadas a PDA, novedosas de alfa-enolasa humana (ENOA) según la reivindicación 1.

Un objeto adicional de la invención son anticuerpos que se unen a estas isoformas fosforiladas de ENOA y las distinguen de otras isoformas de ENOA. Los anticuerpos pueden estar en cualquier formato apropiado, tal como anticuerpos monoclonales (en particular anticuerpos monoclonales humanos) y fragmentos de anticuerpo.

Las proteínas que se han definido como asociadas a PDA en la invención y los anticuerpos que se unen a las mismas (así como cualquier otro medio específico para detectarlos) pueden usarse en métodos para el diagnóstico de PDA, así como para identificar agentes para tratar PDA. En particular, la detección basada en anticuerpos de las isoformas fosforiladas de ENOA asociadas a PDA en muestras biológicas (tales como sueros o biopsias) obtenidas a partir de un paciente pueden usarse en métodos para el diagnóstico de PDA, para evaluar la evolución de la enfermedad o para evaluar los efectos de fármacos para tratar PDA.

Objetos adicionales de la presente invención son kits para el diagnóstico de PDA según la reivindicación 6.

Descripción de las figuras Figura 1: Representación esquemática del método SERPA aplicado para caracterizar anticuerpos y antígenos de proteína asociados a PDA usando células CF-PAC-1 (células tumorales) y sueros a partir de pacientes con PDA (tumores) o donantes (sanos) control.

Figura 2: (A) Gel 2-DE preparado usando un extracto de proteína a partir de la línea celular CF-PAC-1 como ensayo para detectar la expresión de proteína asociada a PDA. Las proteínas en el extracto celular se separaron en el gel según su peso molecular y pI y se revelaron usando tinción con plata. Se indica la posición de puntos presentes en la inmunotransferencia de tipo Western con sueros de PDA, y no con sueros control (el nombre de la proteína específica correspondiente a cada número se enumera en la tabla I) . (B) Histogramas que representan el porcentaje de sueros de pacientes (el número de ellos en cada grupo se indica como n) que están afectados por pancreatitis crónica (CP) o por PDA en diferentes estadios (II, III, IV) que contienen anticuerpos que reconocen las proteínas asociadas a PDA indicadas. El nombre completo de las proteínas correspondiente a los acrónimos se indica en la tabla I.

Figura 3: Alineación de las secuencias de proteína de alfa-enolasa humana (ENOA; n.º reg. de SWISSPROT P06733; SEQ ID NO: 1) y gamma-enolasa humana (ENOG n.º reg. de SWISSPROT P09104; SEQ ID NO: 2) (los aminoácidos que son idénticos en las dos proteínas se indican con ":", mientras que los sólo conservados se indican con ".") . Las secuencias de los péptidos que se han identificado mediante espectrometría de masas en los puntos del gel 2-DE y usado para asignar isoformas de ENOA a tales puntos están subrayadas.

Figura 4: Posición de los sitios de fosforilación (negrita, subrayado) en la secuencia de proteína de alfa-enolasa humana (ENOA) que se pronostican mediante diferentes algoritmos y/o se identifican experimentalmente (letras en minúscula debajo de la secuencia de proteína; véase la leyenda para referencias) . Los péptidos que se identifica... [Seguir leyendo]

1. Isoforma de alfa-enolasa humana caracterizada porque está fosforilada en al menos 3 posiciones, en la que las 3 posiciones se escogen entre Treonina 55, Tirosina 57, Tirosina 200, Tirosina 236, Treonina 237, Tirosina 257 y Serina 419.

5 2. Anticuerpo que se une específicamente a una isoforma de alfa-enolasa según la reivindicación 1.

3. Anticuerpo según la reivindicación 2, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

4. Anticuerpo según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque está fusionado o conjugado a una molécula de marcador detectable.

10 5. Isoforma de alfa-enolasa humana según la reivindicación 1, o anticuerpo según la reivindicación 2, para su uso en el diagnóstico de adenocarcinoma ductal pancreático.

6. Kits para el diagnóstico de adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) , que comprenden la isoforma de alfaenolasa humana según la reivindicación 1, y/o el anticuerpo según la reivindicación 2.

7. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 2 ó 3.

15 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento de adenocarcinoma ductal pancreático.