Un anticuerpo que se fija específicamente a la proteína F de un virus respiratorio sincitial (RSV),

donde elanticuerpo:

a. tiene una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1 como se mide porresonancia de plasmones de superficie;

b. tiene un valor CE50 menor que 3,0 nM en un ensayo de microneutralización para RSV; y

c. comprende las CDRs siguientes con uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones subrayadas yen negrita en una o más de las CDRs:

región de determinación de la complementariedad de la región variable de la cadena pesada (VH)(CDR)1 TSGMSVG (SEQ ID NO:8);

VH CDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:9);

VH CDR3 SMITNWYFDV (SEQ ID NO:10);

región variable de la cadena ligera (VL) CDR1 SASSSVGYMH (SEQ ID NO:5);

VL CDR2 DTSKLAS (SEQ ID NO:6); y

VL CDR3 FQGSGYPFT (SEQ ID NO:7),

en donde dichos uno o más cambios de aminoácidos tienen el efecto de producir un aumento en el valor de kon yaumentar la actividad de microneutralización de dicho anticuerpo.

Anticuerpos recombinantes de alta potencia y método para producción de los mismos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos de alta potencia, métodos de aumento de la potencia de los anticuerpos y uso de anticuerpos de este tipo para prevención y tratamiento de enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Han sido desarrollados, y están siéndolo actualmente, anticuerpos para la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades, especialmente las causadas por microorganismos infecciosos, tales como los virus.

Un enfoque ha consistido en el desarrollo de anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales neutralizantes, algunos de ellos con alta actividad específica de neutralización. Un inconveniente de este enfoque ha sido la necesidad de producir anticuerpos humanos en lugar de los de ratón o rata y minimizar con ello el desarrollo de respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón o anti-rata, lo cual da potencialmente como resultado una patología inmune adicional.

Un enfoque alternativo ha sido la producción de anticuerpos quiméricos humano-murino en los cuales los genes que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de ratón se han acoplado a los genes para regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas a fin de producir anticuerpos quiméricos, o híbridos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV humanizado ha sido preparado y está siendo comercializado actualmente. [Véase: Johnson, Patente U.S. No. 5.824.307].

En algunos casos, se han injertado regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de ratón en regiones constantes y de entramado humanas en las cuales se han insertado algunos de los aminoácidos de entramado de ratón (aminoácidos en la región variable del anticuerpo pero fuera de las CDRs) en sustitución de los aminoácidos posicionados correspondientemente de un anticuerpo humano de la misma especificidad a fin de proporcionar un anticuerpo denominado “humanizado”. [Véase, por ejemplo, Queen, Patentes U.S. No. 5.693.761 y 5.693.762]. Sin embargo, tales anticuerpos contienen regiones CDR de ratón intactas y han alcanzado una eficacia desigual, exhibiendo a menudo afinidades no mayores que 107 a 108 M-1.

WO 9.833.919 describe el anticuerpo humanizado Vitaxin® y anticuerpos injertados afines basados en LM609 monoclonal de ratón.

La producción de anticuerpos de alta potencia (es decir anticuerpos con alta actividad biológica, tal como actividad neutralizante de antígeno) , con inclusión de anticuerpos con afinidad ultraelevada para el antígeno diana, sería deseable desde el punto de vista tanto de la capacidad neutralizante de un anticuerpo de este tipo como desde los aspectos más prácticos de requerir menor cantidad de anticuerpo a fin de conseguir un grado deseable de eficacia clínica, reduciendo con ello los costes de utilización.

La afinidad de los anticuerpos se mide por la constante de fijación del anticuerpo a un antígeno particular, y dicha constante de fijación se calcula a menudo por la ratio de la constante de velocidad para la formación del complejo anticuerpo-antígeno (a la que se hace referencia como el valor “kon”) a la constante de velocidad para la disociación de dicho complejo (el valor “koff”) . De acuerdo con la presente invención, se ha determinado que la potencia de un anticuerpo es una función del valor kon, con indiferencia de la especificidad. La presente invención proporciona así una solución a los problemas de conseguir una alta potencia de anticuerpo en el sentido de que cuanto mayor es el valor kon, tanto mayor es la potencia del anticuerpo, proporcionando con ello anticuerpos de alta potencia y un método para producción de los mismos.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos de alta potencia de acuerdo con la reivindicación 1 útiles en el tratamiento y/o la prevención en una enfermedad. En otro aspecto, la potencia de un anticuerpo aumenta al aumentar la constante de velocidad para la formación del complejo antígeno-anticuerpo (el valor “kon”) .

En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos de alta potencia, distintos de Vitaxin, que incluyen porciones inmunológicamente activas, fragmentos, o segmentos de los mismos, que tienen un kon de al menos 2, 5 x 105 M-1 s-1, con prevalencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7, 5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos pueden tener también afinidad alta (al menos aproximadamente 109 M-1) .

En otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos neutralizantes de alta potencia, que incluyen porciones, fragmentos, o segmentos inmunológicamente activos de los mismos que tienen un kon de al menos 2, 5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7, 5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos pueden tener también afinidad alta (al menos aproximadamente 109 M-1) .

Se describen también métodos para aumentar la potencia de anticuerpos neutralizantes por aumento del valor kon con respecto a un antígeno dado sin cambiar el epítope al que se fija el anticuerpo.

Se describe también un medio de cribado de anticuerpos respecto a propiedades que aseguren alta potencia con respecto a un antígeno deseado, siendo dicha potencia al menos 2 a 10 veces mayor que la de los anticuerpos conocidos.

Más específicamente, es un objeto de la presente invención producir anticuerpos que tienen valores kon al menos tan altos como 2, 5 x 105 M-1 s-1, preferiblemente al menos 5 x 105 M-1 s-1, y muy preferiblemente al menos tan altos como 7, 5 x 105 M-1 s-1.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos de alta afinidad y alta potencia que tienen especificidad alta para la proteína F de un virus respiratorio sincitial (RSV) causante de infección del sistema respiratorio.

En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos que tienen sustancialmente las regiones de entramado (FR) de cadena variable del anticuerpo descrito en la Figura 1 (con la misma especificidad que este anticuerpo) pero en los cuales las estructuras polipeptídicas contienen una o más diferencias de aminoácido en una

o más de las CDRs (o regiones determinantes de la complementariedad) de los mismos. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención diferirán del anticuerpo de las Figuras 1 ó 2 (en lo sucesivo, la “estructura básica” o “estructura de referencia”) únicamente en las secuencias de una o más de las CDRs, que incluyen L1, L2, L3, H1, H2, y H3. Una secuencia preferida se muestra en la Figura 3.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar composiciones que comprenden los anticuerpos descritos en esta memoria en donde dichos anticuerpos están suspendidos en un vehículo, diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable.

Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar composiciones y medicamentos para uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades, tales como las causadas por virus, especialmente el virus respiratorio sincitial, en donde las composiciones y medicamentos comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un anticuerpo como se describe en esta memoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal de afinidad alta cuya potencia puede ser aumentada por los métodos de la presente invención. Para propósitos de referencia, este anticuerpo es la secuencia de anticuerpo MEDI-493 descrita en Johnson et al., J. Infect. Dis., 176:1215-1224 (1997) . En este caso, las regiones CDR están subrayadas, mientras que los residuos no subrayados forman las regiones de entramado de las regiones variables de cada estructura de polipéptido. En esta estructura, las CDRs se derivan de un anticuerpo de ratón, mientras que las regiones de entramado se derivan de un anticuerpo humano. Las regiones constantes (no representadas) se derivan también de un anticuerpo humano. La Figura 1A muestra la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 1) y la Figura 1B muestra la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2) de las cadenas ligera y pesada,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se fija específicamente a la proteína F de un virus respiratorio sincitial (RSV) , donde el anticuerpo:

a. tiene una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 2, 5 x 105 M-1 s-1 como se mide por resonancia de plasmones de superficie;

b. tiene un valor CE50 menor que 3, 0 nM en un ensayo de microneutralización para RSV; y

c. comprende las CDRs siguientes con uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones subrayadas y

en negrita en una o más de las CDRs: región de determinación de la complementariedad de la región variable de la cadena pesada (VH) (CDR) 1 TSGMSVG (SEQ ID NO:8) ;

VH CDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:9) ; VH CDR3 SMITNWYFDV (SEQ ID NO:10) ; región variable de la cadena ligera (VL) CDR1 SASSSVGYMH (SEQ ID NO:5) ; VL CDR2 DTSKLAS (SEQ ID NO:6) ; y VL CDR3 FQGSGYPFT (SEQ ID NO:7) ,

en donde dichos uno o más cambios de aminoácidos tienen el efecto de producir un aumento en el valor de kon y aumentar la actividad de microneutralización de dicho anticuerpo.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende las regiones de entramado de las Figuras 1 ó 2.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 que está aislado.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde el anticuerpo se fija al mismo epítope del antígeno F de RSV que un anticuerpo que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 2B) y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (Figura 2A) .

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la kon es al menos 5 x 105 M-1

- 1

s.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, ó 4, en donde la kon es al menos 7, 5 x 105 M-1 s-1.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo tiene una CE50 menor que 1, 0 nM.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo tiene una constante de afinidad de (Ka) de al menos aproximadamente 109 M-1.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo tiene un Ka de al menos aproximadamente 1010 M-1.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo tiene un Ka de al menos aproximadamente 1011 M-1.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo aislado comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID NO: 24) o TPGMSVG (SEQ ID NO: 25) .

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos DIWWDGKKHYNPSLKD (SEQ ID NO:27) , DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID NO:26) , DIWWDGKKDYNPSLKD (SEQ ID NO:28) , DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID NO:29) , DIWWDGKKSYNPSLKD (SEQ ID NO: 30) , DIWWDDKKSYNPSLKD (SEQ ID NO:55) , o DIWWDGKKSYNPSLKS.

13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos DMITNFYFDV (SEQ ID NO:31) , DMIFNWYFDV (SEQ ID NO:32) , SMITNFYFDV (SEQ ID NO:33) o DMIFNFYFDV (SEQ ID NO:34) .

14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SASSRVGYMH (SEQ ID NO:11) , SLSSRVGYMH (SEQ ID NO:12) , SPSSRVGYMH (SEQ ID NO:13) , LPSSRVGTYMH (SEQ ID NO:56) , o KCQLSVGYMH (SEQ ID NO:59) .

15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos DTFKLTS (SEQ ID NO:14) , DTFKLAS (SEQ ID NO:15) , DTYKQTS (SEQ ID NO:16) , DTRYLSS (SEQ ID NO:17) , DTRGLPS (SEQ ID NO:18) , DTMRLAS (SEQ ID NO:19) , DTFKLSS (SEQ ID NO:20) , DTYRHSS (SEQ ID NO:21) , DTMYQSS (SEQ ID NO:22) , DTFFLDS (SEQ ID NO:57) , DTRYQSS (SEQ ID NO:58) , DTFRLAS, o DTFYLSS.

16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID NO: 23) .

17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo aislado es un anticuerpo monoclonal.

18. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el anticuerpo es un fragmento Fab

o F (ab’) 2.

19. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el anticuerpo es una molécula entera de anticuerpo tetrámero.

20. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable.

21. La composición de la reivindicación 20, para uso como medicamento.

22. La composición de la reivindicación 21, para uso en la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de padecer dicha enfermedad.

23. La composición de la reivindicación 21, para uso en el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.

24. Uso de la composición de la reivindicación 20, para fabricación de un medicamento para prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de dicha enfermedad.

25. Uso de la composición de la reivindicación 20, para fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.

26. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para uso como medicamento.

27. El anticuerpo de la reivindicación 26, para uso en la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de padecer dicha enfermedad.

28. El anticuerpo de la reivindicación 26, para uso en el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.

29. Uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de padecer dicha enfermedad.

30. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.

31. La composición de la reivindicación 22 ó 23, en la cual el paciente es un humano.

32. El uso de la reivindicación 24 ó 25, en el cual el paciente es un humano.

33. El anticuerpo de la reivindicación 27 ó 28, en el cual el paciente es un humano.

34. El uso de la reivindicación 29 ó 30, en el cual el paciente es un humano.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3