ANTICUERPOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE GONADOTROPINA CORIÓNICA EQUINA.

Anticuerpos que modulan la actividad de gonadotropina coriónica equina La invención se refiere al uso de anticuerpos dirigidos frente a la gonadotropina coriónica equina (eCC), para modular la actividad de dicha hormona. Las gonadotropinas juegan un papel importante en el control de las actividades gametogénicas y endocrinas de las gónadas. Estas glicoproteínas complejas están compuestas de dos o ß disimiles, cuya asociación no covalente es necesaria para sus actividades biológicas. Las gonadotropinas pertenecen a la familia de hormonas de glicoproteínas y comprenden hormona luteinizante hipofisaria (LH) y hormona folículo estimulante (FSH) y gonadotropina coriónica humana (hCG) y equina (eCG). Las gonadotropinas se usan actualmente en medicina humana y veterinaria para mimetizar los mecanismos endocrinos de los ciclos sexuales. En seres humanos, la FSH y la hCG se usan para conducir protocolos de fertilización in vitro (FIV) y tratamiento de anovulación. En mamíferos, particularmente rumiantes, se usa comúnmente la eCG, en asociación con un progestógeno, en la inducción y sincronización del estro y tratamientos de ovulación y en tratamientos de súper ovulación. La gonadotropina coriónica equina (eCG) se secreta por las células trofoblásticas en la yegua entre los días 36 y 120 de la gestación (ALLEN and MOOR, J. Reprod. Fertil. 29: 313-316, 1972). De forma curiosa, en las especies esquinas la eCG dimérica se une únicamente al receptor de LH (GUILLOU and COMBARNOUS, Biochim. Biophys. Acta 755: 229- 236, 1983; COM-BARNOUS et al., Ann. Endocr. Paris 45: 261-268, 1984) mientras que la misma muestra actividad de FSH pronunciada adicionalmente a su actividad de LH en especies diferentes a la equina (PAPKOFF, Biochem. Biophys. Res. Commun. 58: 397-404, 1974; COM-BARNOUS et al., FEBS Lett. 90: 65-68, 1978; LICHT et al., J. Endocrinol. 83: 311- 322, 1979). Cada subunidad está compuesta de una parte peptídica conectada a un resto glicánico (cadenas N- y O-). La eCG es la hormona glicoprotéica más pesadamente glicosilada, con una mayoría de glicanos de bi-antena que terminan principalmente en ácidos siálicos que juegan un papel importante en la semi-vida hormonal in vivo (MATZUK et al., Endocrinol. 126: 376-383, 1990). Las cadenas de glicano también están implicadas en la estabilidad de la hormona heterodimérica (HEIKOOP et al., Eur. J. Biochem. 253: 354-356, 1998) y son necesarias para la eficacia de la transducción de señal (MATZUKetal.,J.Biol.Chem. 264:2409-2414,1989;SAIRAMandJIANG,Mol. Cell Endocrinol. 85: 227-235, 1992). La actividad doble de eCG, su semi-vida prolongada y su disponibilidad en grandes cantidades hace que esta gonadotropina única será una hormona exógena conveniente en los tratamientos para inducir y sincronizar el estro y la ovulación. Sin embargo, se ha indicado que el uso repetido de tratamientos de eCG para inducción de ovulación generalmente viene seguido por una fertilidad disminuida que puede disminuir desde el 60 % al 40 % (BARIL et al., Theriogenol. 40: 621-628, 1993; BARIL et al.,Reprod. Domest. Anim.27:161-168, 1992) y este fenómeno se explicó mediante respuestas inmunológicas indeseadas (ROY et al., Biol. Reprod. 60: 805-813, 1999). La presencia de anticuerpos anti-eCG (anticuerpos anti-eCG) en el plasma de cabras y ovejas tratadas con eCG se ha demostrado (BARIL et al., 1993, mencionado anteriormente; BARIL et al., 1992, mencionado anteriormente; ROY et al., 1999, mencionado anteriormente; ROY et al., Biol. Reprod. 61: 209-218, 1999). Un estudio con 2500 hembras (ovejas y cabras) demostró que una inyección de 500 UI de eCG induce una cinética de respuesta inmune humoral rigurosamente similar (RIH) con una concentración de anticuerpo anti-eCG máxima entre 10 y 17 días después de la inyección (ROY et al., 1999, mencionado anteriormente; ROY et al., 1999, mencionado anteriormente). Aproximadamente el 65 % de las hembras tratadas desarrollaron anticuerpos frente a eCG pero los niveles de anticuerpo anti-eCG fueron altamente variables entre los individuos. Informes previos mostraron una asociación significativa entre las hembras que presentan fenotipos de respuesta anti-eCG altos o bajos y alelos de microsatélite particulares localizados dentro del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de clase II (ROY et al., 1999, mencionado anteriormente; ROY et al., 1999, mencionado anteriormente). Los anticuerpos anti-eCG, que ya están presentes para el momento de la inyección de eCG y que se producen como resultado de la respuesta inmune previa frente a eCG un año antes, se definen como: anticuerpos antieCG residuales. Las hembras con una concentración de anticuerpos anti-eCG residuales elevada mostraron una fertilidad significativamente menor después de la inseminación artificial (IA), debido al retardo tanto en la aparición del estro como en el pico de LH preovulatorio (ROY et al., 1999, mencionado anteriormente; ROY et al., 1999, mencionado anteriormente). De forma sorprendente, algunas hembras presentaron una fertilidad significativa después de la IA a pesar de los niveles elevados de anticuerpos anti-eCG residuales. Por lo tanto, para abordar el mecanismo de interferencia inmune sobre la función reproductora inducida por eCG, los inventores han ensayado el impacto de anticuerpos anti-eCG en las bioactividades tanto de LH como de FSH de la eCG. Los inventores han encontrado que los anticuerpos anti-eCG que reconocen principalmente el resto glicánico de eCG, fueron capaces de modular independientemente las bioactividades de LH y FSH, es decir, de estimular las actividades tanto de LH como de FSH o de estimular sólo una de ellas mientras que no tenían efecto o un efecto inhibitorio sobre la otra. También han observado en particular que los anticuerpos antieCG capaces de estimular la bioactividad de FSH de la eCG (mientras que no tienen efecto o un efecto estimulador sobre la actividad de LH) mejoraban enormemente la fertilidad después de la inseminación artificial. La presente invención se refiere a un anticuerpo policlonal anti-gonadotropina coriónica equina (anti-eCG) capaz de mejorar la bioactividad de FSH de gonadotropina coriónica equina (eCG), en el que dicho anticuerpo policlonal tiene las siguientes características: 2   - el mismo reconoce la eCG glicosilada nativa y no reconoce eCG desglicosilada; - el mismo no reconoce LH equina; - el mismo reacciona de forma cruzada moderadamente o marcadamente con la subunidad ß de eCG; - el mismo relaciona de forma cruzada débilmente con la subunidad de eCG. La expresión anticuerpo policlonal incluye molécula de inmunoglobulina completas así como fragmentos de la misma que conservan la especificidad de reconocimiento de antígeno. Esto comprende en particular fragmentos Fab, Fab, F(ab)2 y Fv. Un anticuerpo en el presente documento se define como que no reconoce una forma o subunidad de eCG dada, cuando el porcentaje de reacciones cruzadas de dicho anticuerpo con dicha forma o subunidad es igual a o inferior al 2 % en un ELISA competitivo hacia eCG glicosilada nativa. De la misma manera, un anticuerpo se define como que reacciona de forma cruzada débilmente cuando el porcentaje de reacciones cruzadas es mayor del 2 % e igual o inferior del 10 %; como: reacciona de forma cruzada moderadamente cuando el porcentaje de reacciones cruzadas es mayor del 10 % e igual o inferior del 25 % y como: relaciona de manera cruzada de forma marcada cuando el porcentaje de reacciones cruzadas es mayor del 25 %. De acuerdo con una realización preferida de un anticuerpo policlonal anti-eCG de la invención, adicionalmente es capaz de mejorar la bioactividad LH de gonadotropina coriónica equina y reacciona de forma cruzada marcadamente con la subunidad de eCG. Preferiblemente, los anticuerpos policlonales anti-eCG de la invención no reaccionan de forma cruzada con una isoforma de eCG que tiene un contenido de ácido siálico igual o inferior a aproximadamente el 4,7 %. De acuerdo con realizaciones preferidas: - los anticuerpos policlonales anti-eCG de la invención capaces de mejorar tanto la bioactividad LH como FSH de gonadotropina coriónica equina reaccionan de forma cruzada débilmente con una isoforma de eCG que tiene un contenido de ácido siálico de aproximadamente el 9,5 % y reaccionan de forma cruzada marcadamente con una isoforma de eCG que tiene un contenido de ácido siálico igual a o mayor de aproximadamente el 17,3 %; - los anticuerpos policlonales anti-eCG de la invención capaces de mejorar la bioactividad FSH y que no tienen efecto sobre la actividad LH de gonadotropina coriónica equina no reaccionan de forma cruzada con una isoforma de eCG que tiene un contenido de ácido siálico de aproximadamente el 9,5 % y reaccionan de forma cruzada débilmente con una isoforma de eCG que tiene un contenido de ácido siálico igual a o mayor de aproximadamente el 17,3 %. Los anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo policlonal anti-gonadotropina coriónica equina (anti-eCG) capaz de mejorar la bioactividad FSH de gonadotropina coriónica (eCG), en el que dicho anticuerpo policlonal tiene las siguientes características: - reconoce eCG glicosilada nativa y no reconoce eCG desglicosilada; - no reconoce LH equina; - reacciona de forma cruzada moderadamente o marcadamente con la subunidad ß de eCG; - reacciona de forma cruzada débilmente con la subunidad de eCG. - 2. Un anticuerpo policlonal anti-eCG de la reivindicación 1, caracterizado por que el mismo además es capaz de mejorar la bioactividad LH de gonadotropina coriónica y reacciona de forma cruzada marcadamente con la subunidad ß de eCG. 3. Un anticuerpo policlonal anti-eCG de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para aumentar la eficiencia de eCG para la inducción y sincronización del estro y la ovulación. 4. Una composición farmacéutica para su uso en la inducción y sincronización de estro y ovulación en un mamífero, caracterizada por que la misma comprende un anticuerpo policlonal anti-eCG de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada por que la misma comprende adicionalmente eCG. 12   13   14     16   17