Anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo inhibidor del factor VIII dirigido contra el dominio A2 del factor VIII y capaz de neutralizar la actividad inhibidora del anticuerpo inhibidor diana,

caracterizado porque la región variable de cada una de sus cadenas livianas está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO : 2, y porque la región variable de cada una de las cadenas pesadas está codificada por la secuencia SEQ ID NO : 1.

Anticuerpo antiidiotípico que neutraliza la actividad inhibidora de un anticuerpo inhibidor del factor VIII.

Técnica anterior e introducción

La presente solicitud describe un anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo inhibidor del factor VIII que se une al dominio A2 del factor VIII, una línea celular que produce este anticuerpo monoclonal antiidiotípico, la utilización de este anticuerpo monoclonal antiidiotípico como medicamento y, más particularmente, su utilización para fabricar un medicamento destinado al tratamiento de la hemofilia A.

La hemofilia A es una enfermedad hereditaria vinculada a una anomalía del cromosoma X, que se traduce en una incapacidad para coagular en las personas afectadas. Esta enfermedad es el resultado de mutaciones en el gen de una proteína que interviene en la coagulación, el factor VIII (FVIII) , que determinan una ausencia total de factor VIII en la sangre o un déficit parcial.

La hemofilia A es la más común de las deficiencias que afectan la coagulación sanguínea: en Francia, afecta a 1 hombre de cada 5000, lo que representa un 80% de los pacientes afectados de hemofilia. El otro tipo de hemofilia, la hemofilia B, afecta al 20% de los pacientes afectados de hemofilia; su causa es la deficiencia en otro factor de coagulación, el factor IX.

El tratamiento actual de la hemofilia (de tipo A o B) consiste en administrar, por vía intravenosa, el factor de coagulación deficiente o faltante. En Francia, el factor VIII destinado al tratamiento de las hemofilias está disponible tanto en forma de medicamentos derivados de la sangre, suministrados por el Laboratorio Francés de Fraccionamiento y Biotecnologías (LFB) o por laboratorios farmacéuticos internacionales, como en forma de medicamentos recombinantes producidos por ingeniería genética. En efecto, el ADN que codifica para el factor VIII fue aislado y expresado en células de mamíferos (Wood et al., Nature (1984) 312: 330-337) , y su secuencia en aminoácidos deducida a partir del ADNc.

El factor VIII (FVIII) secretado es una glicoproteína de masa molecular de 300 Kda (2332 aminoácidos) que juega un rol clave en la activación de la vía intrínseca de la coagulación. El FVIII inactivo está constituido por seis dominios: A1 (residuos 1-372) , A2 (residuos 373-740) , B (residuos 741-1648) , A3 (residuos 1690-2019) , C1 (residuos 2020-2172) , y C2 (residuos 2173-2332) , del extremo N-terminal al extremo C-terminal. Tras la secreción, el FVIII interactúa con el factor von Willebrand (vWF) que lo protege de las proteasas plasmáticas. El FVIII se disocia del vWF que es separado por la trombina. Esta separación logra que se elimine el dominio B y se forme un heterodímero. Con esta forma, el FVIII circula en el plasma. Este heterodímero está compuesto por una cadena pesada (A1, A2) y por una cadena liviana (A3, C1, C2) .

Cuando se infunde en un paciente hemofílico, el factor VIII se fija al factor von Willebrand en la circulación sanguínea del paciente. El factor VIII activado actúa como cofactor del factor IX activado, acelerando la conversión del factor X en factor X activado. El factor X activado convierte la protrombina en trombina. La trombina convierte el fibrinógeno en fibrina y se forma un coágulo.

El principal problema que plantea la administración de factor VIII es que aparecen, en el paciente, anticuerpos dirigidos contra el factor VIII, llamados "anticuerpos inhibidores". Estos anticuerpos neutralizan la actividad procoagulante del factor VIII, que se vuelve inactivo apenas se infunde. De este modo, el factor de coagulación administrado se destruye antes de haber podido detener la hemorragia, lo que representa una complicación grave de la hemofilia, en virtud de la ineficacia del tratamiento. Además, algunos pacientes no hemofílicos genéticamente pueden desarrollar inhibidores contra el factor VIII endógeno: se trata de una hemofilia adquirida.

Estudios demostraron que la respuesta inmune anti-factor VIII es de tipo IgG policlonal y pertenece, principalmente, a la subclase IgG4 e IgG1 y, menos frecuentemente, IgG2. Las IgG3 no se representan nunca. La cadena liviana suele ser de tipo Kappa. La sobrerrepresentación de las IgG4 es más acentuada en los hemofílicos que tienen un inhibidor instalado desde hace mucho tiempo. Los dominios C2 y A2 de la molécula de FVIII son los blancos privilegiados de la respuesta inmune aunque, en algunos casos, se detectan anticuerpos dirigidos contra el dominio A3. Al pasar el plasma de pacientes hemofílicos a través de una columna de inmunoadsorción en la que se inmoviliza el FVIII, se pueden purificar los anticuerpos totales anti-FVIII. Las cantidades recogidas suelen superar 100lg por 10mg de IgG totales (Gilles JG et al. (1993) Blood; 82: 2452-2461) . Se desarrolló un modelo animal para estudiar la formación de inhibidores del factor VIII; ratas inmunizadas con factor VIII humano recombinante muestran una respuesta inmune rápida, de tipo policlonal (Jarvis et al. Thromb Haemost. 1996 Feb; 75 (2) :318-25) . Los mecanismos por los cuales los anticuerpos antifactor VIII interfieren con la función del factor VIII son numerosos e incluyen la interferencia en la proteólisis del factor VIII y en la interacción del factor VIII con diferentes asociados como el factor Von Willebrand (vWF) , los fosfolípidos (FL) , el factor IX, el factor X activado (FXa) o la APC (Activated Protein C) .

Hay muchos tratamientos que permiten atenuar las consecuencias de esta respuesta inmune, por ejemplo, los tratamientos que involucran la desmopresina, una hormona sintética que estimula la producción de factor VIII, los agentes promotores de la coagulación, como los concentrados de complejos protrombínicos o los concentrados de complejos protrombínicos activados, el factor VIIa recombinante, la plasmaféresis y las infusiones de cantidades importantes o intermedias de factor VIII. No obstante, estos métodos siguen siendo muy costosos y poco eficaces.

Debido a la complejidad de analizar in vivo esta respuesta inmune policlonal, se aislaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra algunos dominios del factor VIII. Así, se aisló un anticuerpo humano monoclonal de tipo IgG4kappa, LE2E9. Este anticuerpo se dirige contra el dominio C1 del factor VIII e inhibe la actividad cofactor del factor VIII y su unión con el factor Von Willebrand (Jacquemin et al. (2000) Blood 95:156-163) . Del mismo modo, se aisló un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el dominio C2 del factor VIII, llamado BO2C11 (IgG4kappa) producido a partir de un repertorio de células de memoria B de un paciente afectado de hemofilia A con inhibidores (Jacquemin et al. Blood 1998 Jul 15;92 (2) :496-506) . BO2C11 reconoce el dominio C2 del factor VIII e inhibe su unión con el factor Von Willebrand y los fosfolípidos. Inhibe totalmente la actividad procoagulante del factor VIII nativo y activado. Otro ejemplo de anticuerpo monoclonal es el anticuerpo BOIIB2, dirigido contra el dominio A2 del factor VIII. El anticuerpo BOIIB2 inhibe la actividad del factor VIII en un 99%. Al unirse al domino A2, puede interferir e inhibir la fijación del FIXa que posee un sitio de fijación de poca afinidad en esta región del FVIII y, por consiguiente, inhibir la actividad enzimática del FIXa. El segundo modo de acción que puede considerarse es su interferencia en el equilibrio entre la forma heterodimérica (A2:A1 y A3:C1:C2) del FVIII y la forma heterotrimérica (A2 y A1 y A3:C1:C2) del FVIII acelerando la disociación del dominio A2 de estos complejos, volviéndolos no funcionales. (Ananyeva NM et al. (2004) Blood Coagul Fibrinolysis. Mar;15 (2) :109

24. Review) . Gracias a estas nuevas herramientas, otra estrategia de lucha contra los anticuerpos inhibidores del factor VIII, más reciente, considera la administración de anticuerpos antiidiotípicos (anticuerpos que tienen la capacidad de interactuar con la región variable de otros anticuerpos) que neutralizan los anticuerpos inhibidores (Saint-Rémy JM et al. (1999) Vox Sang; 77 (suppl 1) : 21-24) . Un anticuerpo antiidiotípico murino, el 14C12, descrito en el documento WO 2004/014955, neutraliza, in vivo, de modo dosis-dependiente, las propiedades inhibidoras del anticuerpo anti-factor VIII diana (el anticuerpo monoclonal BO2C11) , que se dirige contra el dominio C2 del factor VIII. No obstante, la respuesta inmune anti-factor VIII es policlonal, y no necesariamente todos los anticuerpos inhibidores del factor VIII desarrollados por un paciente se dirigen contra el dominio C2 del factor VIII. Un tratamiento que consiste en la administración de anticuerpos 14C12 solos podría neutralizar únicamente... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo inhibidor del factor VIII dirigido contra el dominio A2 del factor VIII y capaz de neutralizar la actividad inhibidora del anticuerpo inhibidor diana, caracterizado porque la región variable de cada una de sus cadenas livianas está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO : 2, y porque la región variable de cada una de las cadenas pesadas está codificada por la secuencia SEQ ID NO : 1.

2. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo inhibidor del factor VIII dirigido contra el dominio A2 del factor VIII y capaz de neutralizar la actividad inhibidora del anticuerpo diana, caracterizado porque la secuencia peptídica de la región variable de cada una de sus cadenas livianas es una secuencia que posee al menos el 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO : 4, y porque la secuencia peptídica de la región variable de cada una de las cadenas pesadas es una secuencia que posee al menos el 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO : 3.

3. Anticuerpo según la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia peptídica deducida de la secuencia SEQ ID NO : 2 es la secuencia SEQ ID NO : 4 y porque la secuencia peptídica deducida de la secuencia SEQ ID NO : 1 es la secuencia SEQ ID NO : 3.

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo murino.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho anticuerpo antiidiotípico es una IgG1kappa.

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo quimérico.

7. Anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo híbrido humano.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo humanizado.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se trata de un fragmento F (ab') 2, de un fragmento Fab' o de un fragmento Fab.

10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque puede ser producido por la hibridoma 30D1 registrada con el número CNCM I-3450 en la Collection Nationale de Cultures et Microorganismes (CNCM) .

11. Línea celular estable que produce un anticuerpo monoclonal antiidiotípico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Línea celular estable según la reivindicación 11, elegida entre el grupo que consiste en: SP2/0, YB2/0, IR983F, el mieloma humano Namalwa, PERC6, las líneas CHO, fundamentalmente CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7.

29. HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 y P3X63Ag8.653.

13. Hibridoma 30D1 registrada con el número CNCM I-3450 en la Collection Nationale de Cultures et Microorganismes (CNCM) .

14. Fragmento de ADN de secuencia SEQ ID NO : 1 que codifica para la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal antiidiotípico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

15. Fragmento de ADN de secuencia SEQ ID NO : 2 que codifica para la región variable de la cadena liviana de un anticuerpo monoclonal antiidiotípico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Composición farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal antiidiotípico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y al menos un excipiente y/o al menos un vehículo, farmacéuticamente aceptables.

17. Composición según la reivindicación 16, caracterizada porque contiene, al menos, un anticuerpo antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo inhibidor dirigido contra un dominio del factor VIII distinto del dominio A2.

18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizada porque contiene un anticuerpo antiidiotípico dirigido contra el dominio C2 del factor VIII.

19. Utilización de un anticuerpo monoclonal antiidiotípico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la fabricación de un medicamento.

20. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la hemofilia de tipo A, dicha hemofilia de tipo A es una hemofilia con inhibidores.

21. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para neutralizar in vitro la actividad inhibidora de un anticuerpo inhibidor dirigido contra el dominio A2 del factor VIII.

22. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la detección in vitro y/o la purificación de anticuerpos inhibidores del factor VIII.