Una proteína madura que tiene una actividad antagónica frente a proteínas morfogenéticas óseas,

caracterizada porque se obtiene a partir de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:1 de MP52 humana madura convirtiendo al menos un resto entre restos de metionina en la posición 30, 71 y/o 74, o entre restos de triptófano en la posición 32 y/o 35, de dicha secuencia SEC ID NO:1, en un resto de metionina oxidado o alquilado o en un resto de triptófano alilsulfenilado en el anillo indólico, o sustituyendo dichos restos de metionina en la posición 30, 71 y/o 74, o dichos restos de triptófano en la posición 32 y/o 35, de dicha secuencia SEC ID NO:1, por un resto de aminoácido hidrófilo o un resto de aminoácido polar.

Antagonistas de la proteína morfogenética ósea basados en la proteína madura

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

(1) Campo de la invención

Esta invención se refiere a una proteína morfogenética ósea madura de la que se han intercambiado algunos restos de aminoácidos hidrófobos por un resto de aminoácido hidrófilo o polar mediante modificación química o tecnología de ingeniería genética. Las proteínas maduras de esta invención muestran una actividad antagonista frente a proteínas morfogenéticas óseas, y son útiles para agentes médicos para suprimir síntomas de osteogénesis ectópica y calcificación ectópica u osteopatías metabólicas con calcificación, tales como esteosis neurótica, osificación ectópica provocada por estrés de operación, miositis osificante traumática, osificación por defecto de suministro de oxígeno, tumor osteogénico, osificación del ligamento longitudinal posterior, y esclerosis arterial.

(2) Descripción de la técnica relacionada

Una proteína morfogenética ósea (en lo sucesivo denominada BMP) es una proteína que tiene una actividad morfogenética ósea en tejido óseo descalcificado. Aunque se ha trabajado enérgicamente en el aislamiento de BMP desde los años 1970, fue bastante difícil aislarla como una proteína individual. La clonación génica de BMP según se esperaba se llevó a cabo por Wozney en 1989 mediante tecnología de biología molecular, usando las secuencias de aminoácidos derivadas de péptidos desconocidos que se separaron tratando con una enzima la fracción que tiene actividades morfogenéticas óseas. El gen se introdujo inmediatamente en las células cultivadas de animal, y la actividad de la proteína expresada se midió in vivo y se demostró prácticamente la actividad de BMP en la proteína (Wang, E. A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, p. 2220-2224) . Continuando la clonación de una proteína con actividades morfogenéticas óseas utilizando homología, hasta ahora se han aislado varios números de las proteínas con actividades morfogenéticas óseas en una estructura similar. Esas proteínas pertenecen todas a la superfamilia del TGF-! (factor de crecimiento transformante) , y han demostrado tener la actividad para provocar osificación ectópica in vivo, básicamente. Se afirma que la osificación provocada por BMP es cartilaginosa interna, y parece reproducir la formación de hueso largo en una etapa embrionaria. Por lo tanto, la propia BMP se puede usar como un agente médico para el tratamiento para compensar la falta de hueso.

En el documento WO 96/33215 también se ha dado a conocer la actividad morfogenética ósea de una de esas proteínas, denominada MP52. En particular, el documento WO 96/33215 describe una proteína que consiste en 119 restos de aminoácidos que deriva de la región madura de dicha proteína MP52 y muestra la misma actividad morfogenética ósea que la proteína MP52 madura humana.

El documento EP 0 691 349 describe derivados peptídicos sintéticos que tienen actividad antagonista de la proteína morfogenética ósea, que consisten en dos péptidos pequeños y un ligador químico, a través del cual se acoplan los dos péptidos. El documento EP 0 691 349 también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades relacionadas con los huesos, que comprende dichos derivados peptídicos, o una sal terapéuticamente aceptable de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Por otro lado, puesto que se describieron los genes de BMP y se prepararon los anticuerpos específicos frente a las BMPs, las BMPs también se expresaron en el sitio de calcificación ectópica, que hasta ahora no había tenido ningún tratamiento médico, y parece que hay algunas posibilidades de relación entre las BMPs y esas enfermedades. Por ejemplo, se ha puesto recientemente en evidencia que la BMP existe o está incluida en enfermedades tales como osteosis neurótica, osificación ectópica provocada por estrés de operación, miositis osificante traumática, osificación por defecto de suministro de oxígeno, tumor osteogénico, especificado como enfermedades refractarias tales como osificación del ligamento longitudinal posterior (OPLL) (Spine, 17-3S, S33, 1992) y parte de calcificación de esclerosis arterial (J. Clin. Invest., vol. 91, p. 1800, 1993) . Además, los síntomas principales de osificación heterotópica pseudomaligna (PHO) , tumor óseo pseudomaligno y miositis osificante circunscrita son dolor y la aparición de la masa de tejido duro en el músculo. Aunque todavía no se conoce con detalle las causas de estas enfermedades, parece que BMP tiene una relación con la aparición de tejido duro en el músculo de los pacientes. Se considera que BMP existe en el tejido en el que BMP no existe de forma natural, actúa sobre el autocrino, y forma tejido duro semejante a un hueso. Hasta ahora no existe ningún tratamiento eficaz para OPLL. Cuando el síntoma neuronal compresivo es crítico, se realiza una escisión. Sin embargo, el pronóstico no es tan bueno. Tampoco hay ningún tratamiento para la calcificación de arterias.

Parece que la supresión de la existencia de BMP puede ser uno de los tratamientos principales para estas enfermedades. Otro tratamiento, tal como la administración de antagonistas de BMP, también parece eficaz. Se piensa que los receptores de BMP, los anticuerpos neutralizados frente a BMP y los péptidos de BMP que corresponden al sitio de unión, una BMP con resto de aminoácidos específico químicamente modificado, tienen actividad semejante a los antagonistas de BMP.

Hasta ahora se han llevado a cabo muchos estudios respecto a una relación entre la estructura y la actividad de las BMPs, y se especula que algunos sitios de las BMPs maduras se relacionan con la unión al receptor. Se sabe que

un péptido sintetizado basándose en estos estudios funciona como un antagonista frente a las BMPs (solicitud de patente JP, Hei 7 (‘95) - 200175) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Aparte de los péptidos sintéticos, se desea que existan muchos tipos de métodos para la terapia de diversas enfermedades de huesos y cartílagos tales como hiperplasia. El objeto de esta invención es proporcionar una nueva proteína antagonista de BMP como agente terapéutico eficaz para las enfermedades anteriores relacionadas con el hueso, en la que un resto de aminoácido específico se modifica químicamente o se sustituye mediante tecnología de ingeniería genética.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 muestra una comparación de actividades inductoras de ALPasa por MP52s humanas maduras alquiladas en la metionina y aquellas de MP52 humana madura sin modificar, en células MC3T3-E1, que se separaron mediante la diferencia en el tiempo de retención en la HPLC de fase inversa. En la figura, la línea continua con círculos negros representa MPC52 humana madura sin modificar, la línea continua con cuadrados negros representa MP52 humana madura alquilada en una metionina, la línea discontinua con triángulos negros representa MP52 humana madura alquilada en dos metioninas, la línea continua con círculos blancos representa MP52 humana madura alquilada en tres metioninas, la línea discontinua con triángulos blancos representa MP52 humana madura alquilada en cuatro metioninas, respectivamente. Los círculos negros mostrados en el eje Y representan actividad de ALPasa en células no tratadas con ningún reactivo.

La Fig. 2 muestra la actividad antagónica de MP52 humana madura con la metionina oxidada y MP52 humana madura con el triptófano alilsulfenilado en diferentes estirpes celulares. (A) representa sus actividades antagónicas frente a rh-BMP-2 madura en células C3H10T ½, y (B) muestra sus actividades antagónicas frente a MP52 humana madura en células MC3T3-E1, respectivamente. En ambas figuras, la línea continua con círculos negros representa MP52 humana madura con triptófano alilsulfenilado, y la línea discontinua con círculos blancos representa MP52 humana madura con metionina oxidada, respectivamente. En (A) , el cuadrado negro muestra la actividad de ALPasa inducida por 300 ng/ml de rh-BMP-2 madura sola en células C3H10T ½. En (B) , el cuadrado negro muestra la actividad de ALPasa inducida por 600 ng/ml de MP52 humana madura sin modificar sola en células MC3T3-E1. Los cuadrados blancos representan la actividad en los experimentos sin ningún reactivo.

DESCRIPCIÓN DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA

La presente invención se refiere a una proteína madura que tiene una actividad antagónica frente a... [Seguir leyendo]

1. Una proteína madura que tiene una actividad antagónica frente a proteínas morfogenéticas óseas, caracterizada porque se obtiene a partir de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:1 de MP52 humana madura convirtiendo al menos un resto entre restos de metionina en la posición 30, 71 y/o 74, o entre restos de triptófano en la posición 32 y/o 35, de dicha secuencia SEC ID NO:1, en un resto de metionina oxidado o alquilado o en un resto de triptófano alilsulfenilado en el anillo indólico, o sustituyendo dichos restos de metionina en la posición 30, 71 y/o 74, o dichos restos de triptófano en la posición 32 y/o 35, de dicha secuencia SEC ID NO:1, por un resto de aminoácido hidrófilo o un resto de aminoácido polar.

2. La proteína madura según la reivindicación 1, en la que se oxidan los restos de metionina en la posición 30, 71 y/o 74 y además el resto de metionina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de MP52 humana madura de SEC ID NO: 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5.

3. La proteína madura según la reivindicación 1, en la que la reacción de alquilación es S-carboximetilación, en la que al menos un resto de metionina se S-carboximetila, y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6.

4. La proteína madura según la reivindicación 1, en la que los dos restos de triptófano están alilsulfenilados, y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7.

5. La proteína madura según la reivindicación 1, en la que el resto de aminoácido hidrófilo o el resto de aminoácido polar se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, serina y treonina.

6. La proteína madura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha MP52 humana madura es una proteína dímera.

7. Una proteína madura que tiene una actividad antagonista frente a proteínas morfogenéticas óseas, caracterizada porque se obtiene convirtiendo al menos un resto de restos de triptófano en la posición 28 y/o 31 de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2 de BMP-2 humana madura, en la posición 30 y/o 33 de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3 de BMP-4 humana madura, o en la posición 52 y /o 55 de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 4 de BMP-7 humana madura en un resto de triptófano alilsulfenilado en el anillo indólico, o sustituyendo dichos restos de triptófano en la posición 28 y/o 31 de SEC ID NO: 2 de BMP-2 humana madura y/o en la posición 30 y/o 33 de SEC ID NO: 3 de BMP-4 humana madura y/o en la posición 52 y/o 55 de SEC ID NO: 4 de BMP-7 humana madura por un resto de aminoácido hidrófilo o un resto de aminoácido polar en lugar de dicho resto de triptófano.

8. Una proteína madura que tiene una actividad antagonista frente a proteínas morfogenéticas óseas, caracterizada porque se obtiene mediante tecnología de ingeniería genérica sustituyendo

a) al menos un resto de aminoácido de tres restos de aminoácidos hidrófobos en la posición 26, 67 y 70 de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2 de BMP-2 humana madura;

b) al menos un resto de aminoácido de tres restos de aminoácidos hidrófobos en la posición 28, 69 y/o 72 de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3 de BMP-4 humana madura; o c) al menos un resto de aminoácido de tres restos de aminoácidos hidrófobos en la posición 50, 91 y/o 94 de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 4 de BMP-7 humana madura, posiciones las cuales corresponden a aquellas de restos de metionina situados en la posición 30ª, 71ª, y 74ª de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1 de MP52 humana madura, por un resto de aminoácido hidrófilo o un resto de aminoácido polar.

9. La proteína madura según la reivindicación 7 y 8, en la que el resto de aminoácido hidrófilo o el resto de aminoácido polar se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, serina y treonina.

10. La proteína madura según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que dicha BMP-2 humana madura, BMP-4 humana madura, o BMP-7 humana madura es una proteína dímera.

11. Un agente para terapia y/o prevención de osificación ectópica, que contiene una proteína madura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como ingrediente eficaz que muestra una actividad antagonista frente a una proteína morfogenética ósea.

12. Un agente para terapia y/o prevención de enfermedades metabólicas con calcificación, que contiene una proteína madura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como ingrediente eficaz que muestra una actividad antagonista frente a una proteína morfogenética ósea.

13. Un agente para terapia y/o prevención según las reivindicaciones 11 ó 12, en el que dicha osificación ectópica o enfermedad metabólica es osteosis neurótica, miositis osificante traumática, osificación ectópica provocada por estrés de operación, osificación por defecto de suministro de oxígeno, tumor osteogénico, osificación del ligamento longitudinal posterior, osificación heterotópica pseudomaligna, tumor óseo pseudomaligno, miositis osificante

circunscrita, esclerosis arterial y/o enfermedad de Paget.

14. Una composición farmacéutica que comprende una proteína madura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como el ingrediente activo farmacéutico.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que la proteína madura es un antagonista de BMP.

16. Uso de una proteína madura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como reactivo para identificar o 10 evaluar sistemas de agentes médicos que compiten con BMP y la unión al receptor.