Proteína relacionada con GDF-5 recombinante con actividad biológica mejorada

en la que

a) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina,

valina o isoleucina,

y/o

b) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina,

y en la que la misma comprende una secuencia que coincide con una o más de las fórmulas de aminoácidos genéricas siguientes:

a) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSHLEPTNHAX15 IQTLZTNSMX16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX27X28NNVVY X29X30YEX31MVVEX32CGCR o

b) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15 IQTLMNSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX28NNVVYX29X30YEX31MVVEX32CGCR o

c) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15 IQTLZ1NSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LPISILX25X26DX27X28NNVV YX29X30YEX31MVVEX32CGCR

en las que

X1 indica asparagina (N) o serina (S)

X2 indica arginina (R) o lisina (K)

X3 indica alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S)

X4 indica asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X5 indica arginina (R) o lisina (K)

X6 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X7 indica leucina (L) o metionina (M)

X8 indica isoleucina (I) o valina (V)

X9 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X10 indica histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X11 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X12 indica leucina (L), metionina (M) o valina (V)

X13 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X14 indica isoleucina (I) o leucina (L)

X15 indica isoleucina (I) o valina (V)

X16 indica alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X17 indica arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S)

X18 indica alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T)

X19 indica alanina (A), metionina (M) o treonina (T)

X20 indica alanina (A) o prolina (P)

X21 indica serina (S) o treonina (T)

X22 indica alanina (A), serina (S) o treonina (T)

X23 indica arginina (R) o lisina (K)

X24 indica serina (S) o treonina (T)

X25 indica fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X26 indica isoleucina (I) o treonina (T)

X27 indica alanina (A) o serina (S)

X28 indica alanina (A) o glicina (G)

X29 indica asparagina (N) o lisina (K)

X30 indica ácido glutámico (E) o glutamina (Q)

X31 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E),

X32 indica alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T)

Z1 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V),

Z2 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V),

o una secuencia correspondiente en la que la cisteína que es responsable de la formación de dímero se sustituye por un aminoácido diferente o se suprime.

Mutantes de factor del crecimiento de actividad elevada La invención se refiere a mutantes de factor del crecimiento biosintéticos recombinantes novedosos que muestran actividad biológica mejorada. Dicha actividad de proteína mejorada se consigue mediante la sustitución de aminoácidos específicos de las proteínas del factor de crecimiento originales que son proteínas de origen natural de la superfamilia de factor del crecimiento transformante beta de moléculas de señalización. Las proteínas recombinantes proporcionadas en el presente documento son particularmente adecuadas para inducir regeneración, estimulación del crecimiento y diferenciación de diferentes células, tejidos y órganos. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos mutantes de proteínas recombinantes, vectores de expresión y células hospedadoras que contienen las moléculas de ácido nucleico, anticuerpos dirigidos frente a dichos mutantes de proteína, composiciones farmacéuticas y métodos para producir los mutantes del factor de crecimiento.

La superfamilia de proteínas de factor del crecimiento transformante beta (TGF-beta) comprende más de 35 miembros incluyendo TGF-betas, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) , activinas, inhibinas y factores de crecimiento/diferenciación (GDF) . Las proteínas de la superfamilia de TGF-beta promueven la proliferación y diferenciación celular así como la formación de tejido y son relevantes para una amplia diversidad de métodos y aplicaciones de tratamiento médico. Estas moléculas diméricas actúan a través de complejos de receptor específicos que están compuestos de serina/treonina quinasas receptoras de tipo I y tipo II. Las quinasas receptoras posteriormente activan proteínas Smad, que después propagan las señales en el núcleo para regular la expresión génica diana. Las rutas de señalización independientes de Smad también se inician por estos receptores y dan como resultado de la inducción de la ruta de MAP Quinasa. Las Smad son una familia única de moléculas de transducción de señal que pueden transmitir señales directamente desde los receptores de la superficie celular al núcleo, donde las mismas regulan la transcripción interaccionando con compañeros de unión a ADN así como coactivadores y coexpresores transcripcionales.

Los miembros de esta familia de proteínas se sintetizan inicialmente como proteínas precursoras grandes que posteriormente experimentan escisión proteolítica en un grupo de restos básicos de aproximadamente 110-140 aminoácidos desde el extremo C, liberando de este modo la parte de proteína madura del extremo C del prodominio N-terminal. Todos los polipéptidos maduros están relacionados estructuralmente y contienen un dominio bioactivo conservado que comprende seis o siete restos de cisteína canónicos que son responsables del motivo tridimensional característico de "nudo de cistina" de estas proteínas Los diversos miembros de superfamilia se pueden clasificar adicionalmente en subfamilias y grupos diferentes, en base al alcance de la homología/identidad de su motivo de nudo de cistina. Las familias solapantes de proteínas morfogenéticas óseas y factores del crecimiento/diferenciación (GDF) se conoce que juegan un conjunto diverso de papeles en el sistema esquelético y otros tejidos (véase, es decir Ducy y Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214 para una revisión) . Especialmente GDF-5 (la proteína se conoce también como MP52, CDMP-1 o algunas veces como BMP-14) , GDF-6 (CDMP-2, BMP13) y GDF-7 (CDMP-3, BMP-12) humanas se han agrupado en conjunto por varios autores debido a sus propiedades biológicas comparables y el grado extraordinariamente elevado de identidad de secuencia de aminoácidos (véase, es decir Mikic 2004, Annals of Biomedical Engineering 32, 466-476; Wolíman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330) .

Además de las funciones prominentes del subgrupo de GDF-5/-6/-7 en la formación de novo de hueso y cartílago (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130) , se ha demostrado de forma repetida que los miembros de este subgrupo también son inductores y reguladores importantes de tendones y ligamentos (Wolíman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330) , tejidos nerviosos (Farkas et al. 1997, Neurosci Lett. 236, 120-122; Watakabe et al. 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464) , ligamento periodontal y dientes (Sena et al. 2003, J. Dent. Res. 82, 166-171; Morotome et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85-90) y otros tejidos.

Las estructuras de genes y proteínas de diversos BMP/GDF de origen natural incluyendo GDF-5, GDF-6 y GDF-7 se han dilucidado previamente. Se podrían identificar varios mutantes de pérdida de función de GDF-5 los cuales, es decir, conducen al acortamiento de dedos de las manos y de los pies (braquidactília de tipo C) y otras anormalidades esqueléticas tales como braquipodismo en animales (Storm et al. 1994, Nature 368, 639-643) y displasias acromesomélicas en el hombre (Thomas et al. 1996, Nature Gen. 12, 315-317) . Con respecto a estos mutantes se ha observado que las sustituciones de aminoácidos específicas en las posiciones 173, 204, 400, 438, 441 y 498 de GDF-5 humana reducen o abolen completamente la función de la proteína (Schwabe et al. 2004, Amer. J. Med Genet. 124A, 356-363) . Por el contrario, se conocen hasta la fecha únicamente algunos pocos mutantes de GDF con actividad biológica potenciada. Un ejemplo raro se divulga en el documento WO01/11041 y se refiere a GDF-5 monomérico activo que carece del resto de cisteína normalmente responsable de la dimerización.

La búsqueda de las moléculas responsables de la actividad inductora de hueso, cartílago y otros tejidos ha conducido al descubrimiento de un conjunto de moléculas denominadas factores de crecimiento/diferenciación. Debido a sus actividades inductoras de tejido únicas estas proteínas se han aplicado satisfactoriamente en investigación terapéutica y cirugía regenerativa en las cuales las mismas promueven y ayudan al proceso de curación natural de tejidos dañados, bien sea solas o en combinación con materiales de vehículo y o de matriz específicos. Sin embargo existe una necesidad enorme de desarrollar formas mejoradas y más eficaces de estas proteínas para tales propósitos.

Este objeto se resuelve de acuerdo con la invención proporcionando proteínas recombinantes novedosas obtenidas a partir de proteínas relacionadas con GDF-5 que muestran actividad biológica mejorada como se describe en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas.

Con el fin de evitar malos entendidos y ambigüedades, algunos términos usados frecuentemente en el presente documento se definen y se ilustran de la manera siguiente:

El término "domino de nudo de cistina" como se usa en el presente documento significa la región de aminoácidos con alto contenido en cisteína bien conocida y conservada que está presente en las partes maduras de las proteínas de la superfamilia de TGF-beta tales como GDF-5 humana y que forman una estructura de proteína tridimensional conocida como nudo de cisteína. En este dominio, el emplazamiento respectivo de los restos de cisteína con respecto los unos a los otros es importante y se permite que varíe únicamente ligeramente con el fin de no perder la actividad biológica. Las secuencias de consenso para dominios de nudo de cistina se conocen en el estado de la técnica. De acuerdo con la definición definida en el presente documento el dominio de nudo de cistina de una proteína comienza con el primer resto de cisteína que participa en el nudo de cistina de la proteína respectiva y finaliza con el resto que sigue a la última cisteína que participa en el nudo de cistina de la proteína respectiva. Por ejemplo, el dominio de nudo de cistina de la proteína precursora GDF-5 humana (SEC ID Nº 1) comprende los aminoácidos 400-501 (véase también la Figura 1) .

El término "proteína relacionada con GDF-5" como se usa en el presente documento significa cualquier proteína de origen natural o creada artificialmente que comprende un dominio de nudo de cistina con una identidad de aminoácidos de al menos el 60% con el dominio de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humana (aminoácidos 400501 de Figura 1/SEC ID Nº 1) y que porta un resto de metionina en una posición equivalente al resto de metionina 453 (M453) de GDF-5 humana y un resto de metionina o leucina en una posición equivalente a metionina 456 (M456) de GDF-5 humana. Se incluyen las proteínas que pertenecen al grupo de las proteínas GDF-5, GDF-6 y GDF-7 de especies de vertebrados o mamíferos así... [Seguir leyendo]

1. Proteína relacionada con GDF-5 recombinante con actividad biológica mejorada en la que a) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina, y/o b) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina, y en la que la misma comprende una secuencia que coincide con una o más de las fórmulas de aminoácidos genéricas siguientes:

a)

CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSHLEPTNHAX15

IQTLZTNSMX16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX27X28NNVVY

X29X30YEX31MVVEX32CGCR o b) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15

IQTLMNSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX28NNVVYX29X30YEX31MVVEX32CGCR o c) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15

IQTLZ1NSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LPISILX25X26DX27X28NNVV

YX29X30YEX31MVVEX32CGCR

en las que X1 indica asparagina (N) o serina (S) X2 indica arginina (R) o lisina (K) X3 indica alanina (A) , glutamina (Q) , prolina (P) o serina (S) X4 indica asparagina (N) o ácido aspártico (D) X5 indica arginina (R) o lisina (K) X6 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X7 indica leucina (L) o metionina (M) X8 indica isoleucina (I) o valina (V) X9 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X10 indica histidina (H) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) X11 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X12 indica leucina (L) , metionina (M) o valina (V) X13 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X14 indica isoleucina (I) o leucina (L) X15 indica isoleucina (I) o valina (V) X16 indica alanina (A) , asparagina (N) o ácido aspártico (D) X17 indica arginina (R) , asparagina (N) , ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) o serina (S) X18 indica alanina (A) , asparagina (N) , serina (S) o treonina (T) X19 indica alanina (A) , metionina (M) o treonina (T) X20 indica alanina (A) o prolina (P) X21 indica serina (S) o treonina (T) X22 indica alanina (A) , serina (S) o treonina (T) X23 indica arginina (R) o lisina (K) X24 indica serina (S) o treonina (T) X25 indica fenilalanina (F) o tirosina (Y) X26 indica isoleucina (I) o treonina (T) X27 indica alanina (A) o serina (S) X28 indica alanina (A) o glicina (G) X29 indica asparagina (N) o lisina (K) X30 indica ácido glutámico (E) o glutamina (Q) X31 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) , X32 indica alanina (A) , glutamina (Q) , serina (S) o treonina (T) Z1 indica alanina (A) , isoleucina (I) o valina (V) , Z2 indica alanina (A) , isoleucina (I) o valina (V) , o una secuencia correspondiente en la que la cisteína que es responsable de la formación de dímero se sustituye por un aminoácido diferente o se suprime.

2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1,

en la que la proteína relacionada con GDF-5 es una proteína de GDF-5 de vertebrado o un fragmento biológicamente activo o una versión alélica de la misma.

3. Proteína de acuerdo con la reivindicación 2,

en la que la proteína relacionada con GDF-5 es GDF-5 humana (SEC ID Nº 1) o un fragmento biológicamente activo de la misma.

4. Ácido nucleico, que codifica una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a

3.

5. Vector de expresión, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Célula hospedadora, que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Composición farmacéutica, que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 y/o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende adicionalmente sustancias auxiliares y/o de vehículo farmacológicamente aceptables.

9. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en la que la proteína y/o ácido nucleico y/o vector y/o célula hospedadora están contenidos en o sobre un material de matriz biocompatible.

10. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para su uso en el diagnóstico, prevención y/o terapia de lesiones o enfermedades asociadas con hueso o cartílago dañado.

11. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para uso para promover crecimiento de cartílago y/o de hueso y/o fusión espinal, para el diagnóstico, prevención y/o terapia de tejidos de vasos sanguíneos dañados o enfermos y para la inducción de angiogénesis.

12. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha enfermedad asociada con daño de hueso y/o cartílago es osteoporosis.

13. Un método para la producción de una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende preparar de forma recombinante una proteína obtenida a partir de una proteína relacionada con GDF-5 mediante

a) el reemplazo del aminoácido en la posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) con alanina, valina o isoleucina; y/o b) el reemplazo del aminoácido en la posición correspondiente a metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) con alanina, valina o isoleucina.

14. Un anticuerpo que es específico para una proteína relacionada con GDF recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es específico para una región que abarca los aminoácidos correspondientes a los aminoácido.

45. 456 de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEQ ID Nº 1) .

15. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico, prevención y/o terapia de enfermedades asociadas con daño óseo y/o de cartílago o que influye a una enfermedad ósea y/o de cartílago.

16. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para promover formación de cartílago y/o hueso y/o fusión espinal.

17. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico, prevención y/o terapia de tejido de vasos sanguíneos dañado o enfermo.

18. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para la inducción de angiogénesis.

FIG. 4

% de identidad de secuencia con dominio de nudo de cistina de GDF-5 humana