Procedimiento para analizar una muestra sanguínea o una muestra de un derivado sanguíneo usando un sistema hematológico basado en citometría de flujo.

Un procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo que comprende un sistema de deteccion optico,

comprendiendo el procedimiento:

proporcionar un tubo consumible cerrado (60) teniendo en un extremo del mismo un septo que es perforable por una aguja, conteniendo dicho tubo:

un numero conocido de particulas de referencia, teniendo cada una de dichas particulas de referencia un diametro predeterminado y siendo distinguibles de las celulas objetivo de la muestra sanguinea o de la muestra del derivado sanguineo basandose en al menos una medicion optica de una medicion de extincion, una medicion de dispersion anterograda de la luz de angulo pequeno, una medicion de la dispersion de angulo recto, una medicion de la dispersion de la luz de angulo elevado y una medicion de la duracion de vuelo; y al menos un reactivo para permitir la determinacion de la composicion celular de la muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo, comprendiendo el al menos un reactivo al menos un colorante;

perforar el septo con una aguja (11) y alicuotar una primera porcion de sangre completa y un volumen conocido de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11), formando la primera porcion de sangre completa, el volumen conocido de disolucion envolvente, las particulas de referencia y el al menos un reactivo, una primera disolucion;

succionar un volumen conocido de la primera disolucion desde el tubo consumible cerrado (60) en el sistema de deteccion optico a traves de la aguja (11);

usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de eritrocitos, p laquetas y particulas de r eferencia i ndividuales dentro del vo lumen co nocido d e l a primera disolucion, y para medir la absorcion de luz del al menos un colorante dentro del volumen conocido de la primera disolucion;

alicuotar una segunda porcion de sangre y un volumen de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11);

alicuotar una alicuota de lisado en el tubo consumible (60) a traves de la aguja (11), formando el contenido del tubo consumible cerrado (60) y el lisado, una segunda disolucion;

succionar un volumen conocido de la segunda disolucion en el sistema de deteccionoptico a traves de la aguja (11):

usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de los leucocitos, las particulas de referencia y el al menos un colorante individuales dentro del volumen conocido de la segunda disolucion.

Procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo

Esta invencion se refiere en general al analisis de bioparticulas, y mas especificamente a un procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo. Dicho sistema emplea un conjunto de caracteristicas seleccionadas que, en combinacion, proporcionan al menos un recuento sanguineo completo, un recuento diferencial en cinco partes de leucocitos, y un recuento de reticulocitos en un sistema que es pequeno, fiable y lo suficientemente economico como para ser adecuado para su uso en pequenos laboratorios clinicos, consultas medicas, consultas veterinarias y similares. La sangre periferica de los mamiferos contiene habitualmente tres clasificaciones principales de los tipos celulares sanguineos - eritrocitos (red blood cells, "RBCs") , leucocitos (white blood cells, "WBCs) y plaquetas (platelets, "PLT") . Estas celulas estan suspendidas en una disolucion denominada plasma, que contiene muchas proteinas, enzimas e iones diferentes. Las funciones de los componentes plasmaticos engloban la coagulacion sanguinea, el mantenimiento de la osmolalidad, la inmunovigilancia y muchas otras funciones. Los mamiferos tienen habitualmente cualquier cifra entre 2-10 x 1012 eritrocitos por litro. Los eritrocitos son responsables del transporte de oxigeno y de dioxido de carbono en el sistema circulatorio. En muchos mamiferos, incluyendo los seres humanos, los eritrocitos maduros normales tienen una forma transversal biconcava y carecen de nucleo. Los eritrocitos pueden tener un diametro de entre 4 y 9 micrometros, dependiendo de la especie, y tienen un espesor que generalmente es inferior a 2 micrometros. Dentro de los eritrocitos hay una proteina conocida como hemoglobina, que realiza el doble papel de transporte de oxigeno y de dioxido de carbono, y que esta presente a una concentracion muy alta. La hemoglobina es responsable de la coloracion global roja de la sangre, debido a la presencia de hierro en la molecula. En la presente solicitud, los terminos "eritrocitos", "celulas rojas sanguineas", "celulas rojas" y "RBCs" se usan de forma intercambiable para referirse a las celulas sanguineas que contienen hemoglobina presentes en la circulacion, segun se describio anteriormente.

Ademas de los eritrocitos normales, a menudo pueden encontrarse mas formas inmaduras de los eritrocitos en muestras de sangre periferica. La forma ligeramente inmadura de los eritrocitos se denomina reticulocito, y las formas muy inmaduras se denominan ampliamente eritrocitos nucleados (nucleated red blood cells, NRB Cs) . Practicamente todos los animales no mamiferos tienen exclusivamente eritrocitos nucleados en su sangre.

Un reticulocito es un precursor de un eritrocito que ha completado la mayoria de las etapas de desarrollo celular normales en la medula osea, y que ha expulsado su nucleo. La ultima porcion que queda por abandonar del reticulocito antes de que se transforme en un eritrocito realmente maduro es el ARN transferente. La deteccion de los reticulocitos es importante en la evaluacion clinica de la capacidad de los pacientes para producir nuevos eritrocitos. El recuento de reticulocitos tambien puede usarse para distinguir entre los distintos tipos de anemia. En la anemia, la produccion de eritrocitos esta disminuida hasta el punto en que ya no se puede continuar con la eliminacion de eritrocitos, y como resultado el recuento eritrocitario global y el hematocrito son bajos. La presencia de un incremento en el numero de reticulocitos en estos pacientes proporciona una prueba de que la medula osea esta funcionando, y de que esta intentando compensar la deficiencia de eritrocitos. Si hay una cifra baja o n o detectable de reticulocitos en estos pacientes, la medula osea no esta respondiendo adecuadamente a la deficiencia 45 en eritrocitos. Los leucocitos ( white blood cells, WBCs) existen en la sangre periferica en concentraciones muy bajas en comparacion con los eritrocitos. Las concentraciones normales de estas celulas varian entre 5-15 x 109 por litro, lo que es aproximadamente tres ordenes de magnitud menos que los eritrocitos. Estas celulas son generalmente mayores que los eritrocitos, teniendo unos diametros de entre 6 y 13 micrometros, dependiendo del tipo de linfocito y de la especie. Al contrario que los eritrocitos, existe una variedad de tipos celulares de linfocitos que realizan diferentes funciones en el cuerpo. En esta solicitud, los terminos "celulas blancas sanguineas", "celulas blancas" y "WBCs" se usan de forma intercambiable para referirse a las celulas sanguineas nucleadas que no contienen hemoglobina presentes en la circulacion, segun se describio anteriormente.

55 La medicion del numero de leucocitos es importante en la deteccion y la monitorizacion de diversas alteraciones fisiologicas. Unas cifras elevadas de leucocitos anormales son un signo de leucemia, que es una proliferacion incontrolada de una celula mielogena o linfogena. La neutrofilia, o cifras muy aumentadas de neutrofilos, es una indicacion de inflamacion o de destruccion tisular en el cuerpo, por cualquiera que sea la causa.

Los leucocitos pueden clasificarse ampliamente como granulares o agranulares. Las celulas granulares, o granulocitos, se subdividen adicionalmente en neutrofilos, eosinofilos y basofilos. Los linfocitos agranulares se denominan a menudo celulas mononucleares, y se subclasifican en linfocitos y monocitos. Las mediciones de estas dos subclasificaciones principales de los linfocitos (granulocitos y celulas mononucleares) suponen lo que se 65 denomina un recuento diferencial de leucocitos en dos partes (o diferencial en dos partes) . Las mediciones de los componentes de estas subclasificaciones (neutrofilos, eosinofilos, basofilos, linfocitos y monocitos) , producen un

recuento diferencial de leucocitos en cinco partes (o diferencial en cinco partes) .

Los neutrofilos son la mas prevalente de las cinco principales clases de leucocitos, suponiendo habitualmente un poco mas de la mitad del numero total de leucocitos totales. Los neutrofilos se denominan asi porque contienen granulos en su citoplasma, que pueden ser tenidos con una tincion de pH neutro. Estas celulas tienen una vida relativamente corta, del orden de un dia o menos. Los neutrofilos atacan y destruyen bacterias invasoras, y otros agentes extranos en los tejidos o la sangre circulante como parte de los mecanismos de respuesta inmunitaria del cuerpo.

Los eosinofilos son l os siguientes mas prevalentes d e l os granulocitos, por detras de l os neutrofilos, p ero generalmente suponen menos del cinco por ciento del numero total de leucocitos. Los eosinofilos tambien pueden contener granulocitos en su citoplasma, que pueden ser tenidos con una tincion de eosina. Al igual que los neutrofilos, estas celulas no existen durante largos periodos de tiempo en la sangre periferica. Los eosinofilos juegan un papel enlos mecanismosde respuesta inmunitariadel cuerpo que se asocianhabitualmentecon alergiaso infecciones parasitarias.

Los basofilos son los menos comunes de los granulocitos, y los menos comunes de las cinco clasificaciones de leucocitos. Dado que son granulocitos, contienen granulos en su citoplasma que pueden ser tenidos, en este caso usando una tincion a pH basico (alto) . Tambien se sabe que estas celulas juegan un papel en los mecanismos de respuesta inmunitaria del cuerpo, pero no se conocen en concreto.

Los linfocitos son los mas prevalentes de los tipos celulares mononucleares, y generalmente suponen entre el 20 y el 30 por ciento del numero total de leucocitos. Los linfocitos no tienen granulos en su citoplasma, y su nucleo ocupa una gran mayoria del volumen celular. La pequena zona de ci toplasma de l os linfocitos puede tenirse, ya que contiene ARN. Los linfocitos circulan en la sangre periferica, abandonan la circulacion como parte del mecanismo de respuesta inmunitaria del cuerpo, y finalmente retornan a la sangre periferica. Muchos linfocitos son celulas relativamente longevas.

Los monocitos son formas inmaduras de los macrofagos que, por si mismos, tienen poca capacidad para enfrentarse a agentes infecciosos en la sangre circulante. Sin embargo, cuando hay una infeccion en los tejidos que rodean a un vaso sanguineo, estas celulas abandonan la sangre circulante y entran en los tejidos circundantes. Cuando esto se produce, los monocitos experimentan una drastica transformacion para formarlos macrofagos, aumentando su diametro t anto co mo hast a cinco v eces y desarrollando un gr an n umero d e m itocondrias y lisosomas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo que comprende un sistema de deteccion optico, comprendiendo el procedimiento:

proporcionar un tubo consumible cerrado (60) teniendo en un extremo del mismo un septo que es perforable por una aguja, conteniendo dicho tubo:

un numero conocido de particulas de referencia, teniendo cada una de dichas particulas de referencia un diametro predeterminado y siendo distinguibles de las celulas objetivo de la muestra sanguinea o de la muestra del derivado sanguineo basandose en al menos una medicion optica de una medicion de extincion, una medicion de dispersion anterograda de la luz de angulo pequeno, una medicion de la dispersion de angulo recto, una medicion de la dispersion de la luz de angulo elevado y una medicion de la duracion de vuelo; y al menos un reactivo para permitir la determinacion de la composicion celular de la muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo, comprendiendo el al menos un reactivo al menos un colorante;

perforar el septo con una aguja (11) y alicuotar una primera porcion de sangre completa y un volumen conocido de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11) , formando la primera porcion de sangre completa, el volumen conocido de disolucion envolvente, las particulas de referencia y el al menos un reactivo, una primera disolucion;

succionar un volumen conocido de la primera disolucion desde el tubo consumible cerrado (60) en el sistema de deteccion optico a traves de la aguja (11) ;

usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de eritrocitos, p laquetas y particulas de r eferencia i ndividuales dentro del vo lumen co nocido d e l a primera disolucion, y para medir la absorcion de luz del al menos un colorante dentro del volumen conocido de la primera disolucion;

alicuotar una segunda porcion de sangre y un volumen de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11) ;

alicuotar una alicuota de lisado en el tubo consumible (60) a traves de la aguja (11) , formando el contenido del tubo consumible cerrado (60) y el lisado, una segunda disolucion;

succionar un volumen conocido de la segunda disolucion en el sistema de deteccionoptico a traves de la aguja (11) :

usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de los leucocitos, las particulas de referencia y el al menos un colorante individuales dentro del volumen conocido de la segunda disolucion.

2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicho diametro de cada una de dichas particulas de referencia esta entre 1 micrometro y 10 micrometros.

3. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra del derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60) , dicho numero conocido de particulas de referencia esta entre aproximadamente 103 y aproximadamente 105 por !l de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.

4. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas particulas de referencia se eligen del grupo formado por particulas de latex, celulas fijadas, polen, vidrio y coloides grandes.

5. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo es eficaz para permitir q ue dicho si stema hematologico basado e n ci tometria de f lujo cu ente a l menos uno de eritrocitos y reticulocitos en una muestra sanguinea o muestra de derivados sanguineo.

6. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye un reactante capaz de tenir el acido ribonucleico [ARN] en reticulocitos.

7. El procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que dicho reactante capaz de tenir el acido ribonucleico [ARN] en reticulocitos es azul de metileno nuevo.

8. El procedimiento segun lareivindicacion 7, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra del derivado sanguineo est a en dicho t ubo co nsumible ce rrado ( 60) , di cho az ul d e m etileno nu evo est a pr esente a un a concentracion de ent re a proximadamente 0, 1 hast a apr oximadamente 0, 5 gr amos por l itro de u na di solucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra del derivado sanguineo.

9. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye un reactante capaz de modificar la forma de los eritrocitos, pero que por lo demas deja los eritrocitos practicamente intactos.

10. El procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que dicho reactante capaz de modificar la forma de l os eritrocitos, pero que por lo demas deja los eritrocitos practicamente intactos, es Plurafac-A-39-Pric.

11. El procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60) , dicho Plurafac-A-39-Pric esta presente a una concentracion de entre 0, 1 y 0, 6 gramos por litro de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.

12. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye azul de metileno nuevo y dicho Plurafac-A-39-Pric.

13. El procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra de derivado sanguineo est a en dicho t ubo co nsumible ce rrado ( 60) , di cho az ul d e m etileno nu evo est a pr esente a un a concentracion de entre 0, 1 y 0, 5 gramos por litro de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra del derivado sanguineo, y dicho Plurafac-A-39-Pric esta presente a una concentracion de entre 0, 1 y 0, 6 gramos por litro de una disolucionformada por dicho reactivoy dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.

14. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye:

a) azul de metileno nuevo, a una concentracion de entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 0, 5 gramos por litro;

b) Plurafac-A-39-Pric, a una concentracion de entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 0, 6 gramos por litro;

c) bicarbonato sodico, a una concentracion de entre aproximadamente 6, 0 y aproximadamente 10, 0 gramos por litro;

d) cloruro sodico, a una concentracion de entre aproximadamente 1, 0 y aproximadamente 5, 0 gramos por litro;

e) Tricina, a una concentracion de entre aproximadamente 1, 0 y aproximadamente 5, 0 gramos por litro;

f) EDTA disodico, a una concentracion de entre aproximadamente 0, 5 y aproximadamente 3, 0 gramos por litro;

g) etilparabeno a una concentracion de entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 0, 5 gramos por litro; y h) metilparabeno a una concentracion de entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 0, 3 gramos por litro, en el que cada una de dichas concentraciones es la concentracion por litro de una disolucion formada por dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo y dicho reactivo, cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60) .

15. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo es eficaz para permitir la medicion de al menos uno de recuento de leucocitos, diferencial de leucocitos en cinco partes y niveles de hemoglobina.

16. E l pr ocedimiento s egun cu alquiera de l as reivindicaciones precedentes, en e l que dicho r eactivo i ncluye saponina, a una concentracion de entre 6, 0y 20, 0 gramospor litro de la disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra del derivado sanguineo cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60) .

17. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente:

en el que cada una de dichas concentraciones es la concentracion por litro de una disolucion formada por dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo y dicho reactivo, cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60) .

18. E l pr ocedimiento se gun cu alquiera d e l as reivindicaciones precedentes, e n el que d ichas particulas son 15 particulas de latex.

19. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho diametro de cada una de dichas particulas es de 4, 0 º 0, 5 micrometros.

20. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60) , dicho numero conocido de particulas es de 10.000 º 1.000 por !l de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.