ANÁLISIS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER BASADO EN LA DETERMINACIÓN DE LA PROPORCIÓN DE PRODUCTOS DE ESCISIÓN AB DE SECRETASA.

Análisis para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer basado en la determinación de la proporción de productos de escisión Aß de secretasa La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) o de una determinada etapa de la enfermedad, que se basa en la determinación de la proporción de al menos dos productos de escisión de la secretasa, Aß48, Aß45, Aß42, Aß38 y Aß35, en el que se determina al menos la proporción de Aß38:Aß42. Una disminución de la proporción de Aß38:Aß42 en comparación con la proporción normal indica la EA. Para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) y para distinguir la EA de otras demencias, se usan diversos procedimientos. Estos procedimientos de diagnóstico comprenden el barrido del cerebro mediante tomografía informatizada (CT), generación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o tomografía de emisión de positrones (PET) para visualizar las anomalías del cerebro. Otro enfoque de diagnóstico es el miniexamen del estado mental (MMSE), que se basa en la evaluación de determinados problemas cognitivos (memoria a corto plazo, memoria a largo plazo, pruebas de repetición) que, por tanto, permite una evaluación diferente de la capacidad del paciente en lo que respecta a la resolución de problemas, la competencia lingüística, etc. Según los neurólogos, geriatras y psiquiatras, quienes están familiarizados con una variedad de demencias, este examen permite obtener un diagnóstico preciso. Así pues, el MMSE constituye la base del diagnóstico actual. Otro procedimiento de diagnóstico adicional se basa en la determinación de compuestos que son característicos de la enfermedad (marcadores bioquímicos, biomarcadores) en fluidos corporales como la sangre, líquidos, orina, etc., en el que se usan pruebas de laboratorio selectivas. Ese enfoque permite la determinación de los cambios en las concentraciones debidos a la enfermedad, incluso en una fase temprana de la enfermedad, cuando los síntomas clínicos pueden ser leves y poco claros. En cualquier caso, este análisis es problemático, pues es necesario determinar bajas concentraciones de marcadores bioquímicos selectivamente para el diagnóstico temprano y para distinguir con exactitud entre la EA y otras demencias. Para aumentar la exactitud del diagnóstico, se usan determinados marcadores bioquímicos como la proteína ßamiloide y la proteína tau. Se ha sugerido que el nivel de tau en el líquido cefalorraquídeo (LCR) refleja la degeneración neuronal y axonal o, posiblemente, la formación de ovillos neurofibrilares. Por consiguiente, tau es considerada como un biomarcador general de una disfunción neuronal (CreutzfeldtJacob, EA, etc.). Los niveles de tau aumentan moderadamente en la EA (hay un mayor aumento en la IDC) y en otras enfermedades neurodegenerativas, mientras que la tau con fósforo aumenta mucho en la EA. Actualmente, el amiloide ß (Aß) se considera el parámetro de diagnóstico más importante, pues este péptido es responsable de las deposiciones extracelulares de tipo placa (amiloidosis) en el cerebro, que es un rasgo característico temprano del curso de la EA. La APP es una proteína de la transmembrana (TM) de tipo 1 que sufre el procesamiento proteolítico realizado por diversas secretasas. En primer lugar, es necesario retirar la carga del ectodominio mediante o ßsecretasas unidas a la membrana que conducen a las formas secretadas de APP y a los fragmentos Cterminales unidos a la membrana CTF o ßCTF, respectivamente. La proteolisis intramembranosa regulada (PIR) de ßCTF realizada por la secretasa sólo tiene lugar tras la retirada del ectodominio, y libera el péptido Aß de la membrana. El complejo secretasa activo consiste en cuatro subunidades, presenilina1 (PS1), APH1, PEN2 y nicastrina. La PS1 contiene dos residuos aspartato activos catalíticos en los TMS6 y TMS7. PS1 es escindida endoproteolíticamente y se observó la existencia de fragmentos Nterminales y Cterminales en forma de dímeros en el núcleo catalítico de secretasa. Los terminales amino de los cabos de CTF son reconocidos por la nicastrina, que funciona como un receptor del sustrato de la secretasa. La secretasa escinde por sitios variables, generando así péptidos Aß de varias longitudes. Los péptidos Aß están estrechamente ligados a la EA, pues se acumulan formando placas amiloides. Aß42 es la forma más relevante de las especies de Aß desde el punto de vista patológico, pues tiene una mayor tendencia a agregarse y se encuentra a un nivel elevado en los cerebros de pacientes de EA. Un mecanismo recientemente descrito de escisión de la secretasa implica etapas secuenciales de escisión proteolítica para liberar Aß. Por consiguiente, el primer corte tiene lugar en el borde citoplasmático del segmento transmembrana (TMS), en el sitio , i.e., el residuo 49 de ßCTF. El producto Aß49 permanece unido a la membrana y luego se procesa en un modo de acciones secuenciales en Aß46 (sitio ) y Aß40 o Aß42 (sitio ) (Figura 4A). Recientemente, se ha publicado que la proteína Notch es procesada por la secretasa mediante un mecanismo secuencial similar. Previamente, se observó que la APP forma homodímeros, como se ha observado para otros sustratos de secretasa, p.ej., el receptor tirosina quinasa ErbB4 y Ecadherina. Es probable que la homodimerización de la APP esté mediada por dos sitios diferentes del ectodominio, la región bucle que engloba los residuos 91111 y un segundo sitio que se solapa con el sitio de unión al colágeno, que abarca los residuos 448465. En un estudio reciente, se compararon los niveles de Aß40 y Aß42 de pacientes con la EA y de individuos sanos. 2 E06011829 01-12-2011   Se pudo observar que no había diferencias en ambos grupos en lo que respecta a los niveles de Aß40. Sin embargo, los pacientes de la EA mostraron menores niveles de Aß42. Desafortunadamente, las concentraciones absolutas de Aß42 observadas en diversos pacientes de EA difieren de manera espectacular (individuos con altas frente a individuos con bajas). Estas variaciones de los valores de las concentraciones absolutas demuestran que los datos obtenidos han sido afectados por diversos factores (estado de la muestra, sistema analítico usado, etc.). Por consiguiente, es casi imposible establecer los valores límite que se requieren para el desarrollo de un análisis de diagnóstico fiable. Además, en el transcurso de la enfermedad de EA esporádica, se pudieron observar varios niveles de amiloide. Por consiguiente, no basta únicamente con la determinación de la concentración de Aß42 para obtener un diagnóstico preciso de la EA. En otras palabras, actualmente, no hay ningún marcador fiable disponible para el diagnóstico de la EA, de una determinada fase de la EA o para el diagnóstico de un riesgo elevado de desarrollar la EA. (Inserción de página 3a). Así pues, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar un marcador para el diagnóstico (temprano) fiable de la enfermedad de Alzheimer (EA) o de una determinada fase de dicha enfermedad. Wiltfang et al., J. of Neurochemistry, 81 (2002), p. 481496 describen patrones muy conservados y específicos de la enfermedad de los péptidos Aß truncados carboxiterminalmente 137/38/39, además de 140/42 en la enfermedad de Alzheimer y en pacientes con neuroinflamación crónica. Blennow, K., NeuroRx, Vol. 1 (2004), pp. 213225 describen biomarcadores proteicos del líquido cefalorraquídeo para la enfermedad de Alzheimer. Andreasen et al., Clinical Neurology and Neurosurgery, 107 (2005), pp. 165173 describen biomarcadores del LCR para el deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer temprana. Golde et al., Biochemica and Biophysica Acta 1502 (2000), pp. 172187 es un artículo de revisión sobre la detección bioquímica de isoformas Aß. La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Durante los experimentos que conducen a la presente invención, se pudo identificar un motivo GxxxG que media las interacciones entre hélices en el segmento transmembrana de la APP. Este motivo representa un sitio de interacción homofílico exclusivo del CTF del sustrato secretasa y controla el procesamiento en Aß mediante escisiones finales de la secretasa. Las mutaciones de este motivo y el posterior análisis de las especies de Aß revelaron la generación de cortes consecutivos por los dos conjuntos de escisiones identificados, (I) 4946 43403734 y (II) 4845423835 (numeración de Aß). Cada vez hay más pruebas de que estas especies se generan mediante escisiones consecutivas entre giros de hélice realizadas por la secretasa partiendo del terminal C y avanzando hacia el terminal N del sustrato de ßCTF. Estos descubrimientos tienen un impacto directo en los enfoques de diagnóstico que controlan... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) o la fase de la EA, procedimiento que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un paciente con sondas que se unen específicamente con al menos dos productos de escisión de secretasa Aß48, Aß45, Aß42, Aß38 y Aß35; y (b) determinar las cantidades de dichos productos de escisión en dicha muestra, en la que se determina al menos la proporción Aß38:Aß42, y una menor proporción de Aß38:Aß42 en comparación con una proporción normal indica la EA. 2. Un procedimiento para controlar el progreso de una terapia contra la EA, procedimiento que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un paciente con sondas que se unen específicamente con al menos dos productos de escisión de secretasa Aß48, Aß45, Aß42, Aß38 y Aß35; y (b) determinar las cantidades de dichos productos de escisión en dicha muestra, en la una proporción normalizada de dichos productos de escisión en comparación con la proporción al inicio de la terapia indica un efecto terapéutico. 3. Un procedimiento de diagnóstico para distinguir entre la enfermedad de Alzheimer (EA) y otra enfermedad que no sea Alzheimer, procedimiento que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un paciente con sondas que se unen específicamente con los productos de escisión de secretasa Aß42, Aß40 y Aß38; y (b) determinar las cantidades de dichos productos de escisión en dicha muestra, en la una proporción de Aß38:Aß42 > 1 en combinación con una proporción normal de Aß42:Aß40 indica una enfermedad que no es la EA. 4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que se determina la proporción de Aß38:Aß42. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que (i) una menor proporción de Aß38:Aß42 en comparación con la proporción normal y una mayor concentración de Aß42 en comparación con la concentración normal indica una etapa temprana de la EA y (ii) una menor proporción de Aß38:Aß42 en comparación con la proporción normal y una concentración menor o normal de Aß42 en comparación con la concentración normal indica una etapa tardía de la EA. 6. El procedimiento de la reivindicación 4 ó 5, en el que la proporción de Aß38:Aß42 es 1,5. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra es LCR o sangre. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las sondas son anticuerpos. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el procedimiento se lleva a cabo como un ELISA. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el ELISA es un ELISA de tipo sándwich. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende la determinación de la concentración de al menos un biomarcador adicional que comprende (i) la proporción de Aß42:Aß40; (ii) la concentración de Aß37 o Aß40; o (iii) la concentración de tau con fósforo. 13. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la terapia comprende el tratamiento con un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) o estatina. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) es MPC 7869 (Rflurbiprofeno). 11 E06011829 01-12-2011   12 E06011829 01-12-2011   13 E06011829 01-12-2011   14 E06011829 01-12-2011   E06011829 01-12-2011   16 E06011829 01-12-2011