Un método para llevar a cabo un análisis para una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis,

este método comprende:

(a) llevar a cabo una reacción en una solución entre una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis y un compuesto marcador fluorescente, la muestra y el compuesto marcador siendo combinadas en el momento t0;

(b) excitar la fluorescencia en el compuesto marcador, en donde la naturaleza del marcador y la naturaleza de la excitación son tales que la mencionada fluorescencia tiene lugar a una longitud de onda en la que dicha fluorescencia es alterada por la reacción del compuesto marcador con la sustancia no fluorescente;

(c) detectar, en múltiples puntos temporales la fluorescencia resultante mientras progresa la reacción;

(d) calcular de la fluorescencia detectada los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con l compuesto marcador, por ajuste de curva de la fluorescencia detectada y extrapolar la curva al momenti t0 y al t∞.

(e) calcular de los valores de F0 y F∞ el cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción en el paso (a) ; y

(f) determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado la concentración de la sustancia no fluorescente presente en la muestra en t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente.

Analisis de fluorescencia [0001] La presente invención se refiere a métodos para realizar un análisis para una sustancia no-fluorescente en una muestra, y además se refiere al aparato para la realización de análisis de acuerdo a tales métodos.

La Patente Europea número EP 0.772.779 describe el análisis de proteínas glicosiladas por extinción de fluorescencia. El estado de la técnica como se ejemplifica en este documento describe el análisis de hemoglobina glicosilada usando la extinción de la fluorescencia producida cuando la mencionada hemoglobina glicosilada se enlaza a un conjugado producido por el enlace químico de fluorofóros a grupos de ácido borónico. Esta extinción dependiente de la concentración es después comparada con una medición de la hemoglobina total hecha por medios fotométricos convencionales, que está establecida en el estado de la técnica.

Sin embargo durante el método del estado de la técnica hay un nivel no específico inevitable de extinción de fluorescencia que no es causado por el enlace del mencionado conjugado a la hemoglobina glicosilada sino por un efecto de filtro inherente. Este efecto de filtro inherente es causado por la molécula de hemoglobina de por sí absorbiendo tanto la radiación excitante como la luz fluorescente emitida causada por superposición espectral del espectro de absorción de la hemoglobina con la excitación de fluorescencia y el espectro de emisión. Esta extinción de fluorescencia de fondo debe ser compensada en el cálculo para permitir la cuantificación de la extinción específica que es atribuida solamente a la concentración de hemoglobina glicosilada y por la tanto a su parte. Los inventores de la EP 0.772.779 consiguieron esto determinando la densidad óptica de la solución de la reacción a una longitud de onda adecuada (por ejemplo 405 nm o 415 nm) y restando un elemento a prorrata de la extinción de fluorescencia total dependiendo de su medición de densidad óptica.

En el método revelado en la EP 0.772.779 la concentración total de hemoglobina se mide usando métodos fotométricos convencionales como la absorbancia a 405 nm o 415 nm. Para que ese método funcione como se describe en la misma el usuario debe hacer dos mediciones independientes en instrumentos separados: un fotómetro para medir la densidad óptica total y un fluorímetro para medir la extinción de fluorescencia. Para que las pruebas tengan alguna utilidad comercial, por ejemplo en el tratamiento de la diabetes, cualquier instrumento diseñado y fabricado específicamente para la prueba debe por consiguiente tener una funcionalidad dual de tanto fluorímetro como fotómetro. Esto es costoso, más complejo e indeseable.

La extinción de la fluorescencia por la hemoglobina como se describe en la EP 0.772.779 tiene dos componentes. El primero, una caída instantánea inicial en la fluorescencia asociada con el espécimen de hemoglobina actuando como un filtro de densidad neutro en la excitación de la fluorescencia y en las longitudes de onda de emisión; y el segundo una extinción dependiente del tiempo de la señal de fluorescencia asociada con el curso temporal del enlace químico de la hemoglobina glicosilada con el reactivo conjugado fluorescente.

La presente invención pretende superar los problemas del método del estado de la técnica, como se ha descrito anteriormente y se detalla más adelante, con la esperanza de desarrollar un método de análisis significativamente mejorado, así como diseñar instrumentos automáticamente para conseguir los resultados deseados. Como un resultado de este estudio cuidadoso. Los presentes inventores han comprobado que siguiendo el curso temporal de alteración de la fluorescencia mientras la reacción del análisis progresa, la alteración de la fluorescencia de fondo, es decir, una disminución o aumento instantáneo no dependiente de la química de la reacción, puede ser determinada separadamente de la extinción de la fluorescencia dependiente del tiempo atribuida al enlace químico del compuesto objetivo con el reactivo fluorescente. Por lo anterior han descubierto también que una alteración en la fluorescencia detectada, en particular un efecto de extinción, cuando una sustancia es añadida al reactivo fluorescente puede ser usada para calcular la concentración de esa sustancia que no es fluorescente por sí misma.

De acuerdo a un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para llevar a cabo un análisis para una sustancia no fluorescente en una muestra, este método comprende:

(a) llevar a cabo una reacción en una solución entre una sustancia no fluorescente en una muestra del análisis y un compuesto marcador fluorescente, la muestra y el compuesto marcador siendo combinados en el momento para;

(b) excitar la fluorescencia en el compuesto marcador, en donde la naturaleza del marcador y la naturaleza de la excitación son tales que la mencionada fluorescencia tiene lugar a una longitud de onda a la que la mencionada fluorescencia es alterada por la reacción del compuesto marcador con la sustancia no fluorescente;

(c) detectar, en múltiples puntos temporales, la fluorescencia resultante mientras progresa la reacción;

(d) calcular de la fluorescencia detectada los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y Fr siendo la fluorescencia en el momento tr que es el punto en el que toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con el compuesto marcador, o la reacción ha alcanzado el equilibrio, por ajuste de la curva de la fluorescencia detectada y extrapolando la curva al momento t0 y tr;

(f) determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado la concentración de sustancia no fluorescente presente en la muestra en el t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente.

Como se usa en la presente, cuando se hace referencia a una sustancia a ser ensayada (el analito) el término no fluorescente no significa que la sustancia es totalmente no fluorescente. En cambio significa que tienen un espectro de excitación y/o emisión diferente al del compuesto marcador fluorescente en las longitudes de onda de excitación y emisión relevantes.

Un uso principalmente pretendido de la presente invención es en el análisis de la hemoglobina glicosilada en sangre. De hecho, la génesis de la presente invención reside en mejorar un proceso para este análisis, y en particular analizar la cantidad o proporción de hemoglobina glicosilada (es decir, hemoglobina a la que la glucosa se ha vuelta enlazada no enzimáticamente) dentro de una muestra. Por esta razón la siguiente descripción describirá a menudo la invención respecto a esto, aunque la presente invención es igualmente aplicable para el análisis de muchas sustancias diferentes – en particular sustancias donde las características de absorción de los contenidos de la muestra son propensas a interferir con las características fluorescentes de un fluoróforo apropiado.

El primer aspecto de la presente invención requiere un compuesto marcador que es específico para la sustancia a ser analizada y la fluorescencia de la cual está apropiadamente alterada (posiblemente aumentada, pero más habitualmente disminuida) por el enlace del marcador con la sustancia.

El compuesto marcador habitualmente comprenderá un fluoróforo y un grupo de enlace adaptado para enlazar selectivamente con la sustancia. La selección de un fluoróforo apropiado y combinación de grupo de enlace para una sustancia objetivo particular puede ser hecha en base a prueba experimental o a las características conocidas de los fluoróforos y grupos de enlace existentes en relación a la sustancia a ser analizada. Una variedad de fluoróforos se menciona en la EP 772.779, el contenido de la cual está incorporado en la presente por referencia. Para una proteína glicosilada como la hemoglobina glicosilada un marcador adecuado podría incluir un grupo de ácido borónico enlazado por un grupo conector con un derivado de la fluoresceína. El ácido borónico enlaza en grupo cis-diol de una proteína glicosilada pero no es específico de la proteína. Se prefiere que el método se adapte específicamente para la detección de hemoglobina glicosilada y un marcador adecuado para esto podría tener la fórmula:

El algoritmo de calibración usado en la sección (f) puede ser de la forma y = mx + c, donde m y c son las constantes de calibración de intersección y pendiente y x = (F0 -F∞) /F0. La sustancia no fluorescente objetivo puede ser una subespecie (por ejemplo, hemoglobina glicosilada) de una sustancia principal (por... [Seguir leyendo]

1. Un método para llevar a cabo un análisis para una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis, este método comprende:

(a) llevar a cabo una reacción en una solución entre una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis y un compuesto marcador fluorescente, la muestra y el compuesto marcador siendo combinadas en el momento t0;

(b) excitar la fluorescencia en el compuesto marcador, en donde la naturaleza del marcador y la naturaleza de la excitación son tales que la mencionada fluorescencia tiene lugar a una longitud de onda en la que dicha fluorescencia es alterada por la reacción del compuesto marcador con la sustancia no fluorescente;

(c) detectar, en múltiples puntos temporales la fluorescencia resultante mientras progresa la reacción;

(d) calcular de la fluorescencia detectada los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con l compuesto marcador, por ajuste de curva de la fluorescencia detectada y extrapolar la curva al momenti t0 y al t∞.

(e) calcular de los valores de F0 y F∞ el cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción en el paso (a) ; y

(f) determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado la concentración de la sustancia no fluorescente presente en la muestra en t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el antes del paso (a) el compuesto marcador es excitado y la fluorescencia resultante inicial (FEn blanco) se detecta en ausencia de la sustancia no fluorescente.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que los valores de F0 y FEn blanco se usan para 25 calcular la densidad de fluorescencia óptica (FOD) usando la ecuación:

FOD = Log [FEn blanco/F0] (Ecuación 1)

4. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el cálculo de los valores F0 y F∞ en el paso (d) incluye ajustar una función matemática de una curva de mejor ajuste a los datos de fluorescencia detectados en el paso (c) y extrapolar esa función al momento t0 y t∞.

5. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el algoritmo de

calibración usado en la sección (f) es de la forma y = mx + c, donde m y c son las constantes de calibración de35 pendiente e intercepción, y es la concentración de la sustancia no fluorescente en el t0 y x = (F0 -F∞) /F0.

6. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la sustancia no fluorescente es una subespecie de una sustancia principal, y la subespecie es selectivamente reactiva con el compuesto marcador, y en donde la concentración total de la sustancia principal y la subespecie presente en la muestra en el t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente, se determina de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado de la forma y = m'x + c'; donde m' y c' son las constantes de calibración de pendiente e intercepción, y es la concentración total de la sustancia principal incluyendo la subespecie presente en la muestra en el t0 t x = Log (FEn blanco/F0) .

45 7. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sustancia a ser analizada es una proteína glicosilada, y preferiblemente es hemoglobina glicosilada.

8. Un método como se reivindica en la reivindicación 7, en donde el compuesto marcador contiene un grupo de ácido borónico capaz de enlazar selectivamente con el grupo cis-diol de la proteína glicosilada.

9. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto marcador fluorescente tiene una longitud de onda de excitación principal en el intervalo de 200 nm a 800 nm, y preferiblemente de aproximadamente 510 nm.

55 10. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el marcador fluorescente es seleccionado del grupo consistente de compuestos que contienen residuo de fluoresceína; compuestos de la fórmula F-NH-CS-NH-Ph-B (OH) 2 donde Ph es un grupo fenilo y F es un residuo de fluoresceína; y un compuesto de la fórmula I:

11. Un método como es reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es una muestra sanguínea, una muestra de plasma, una muestra de suero, o una muestra de orina.

12. Aparato para el análisis de una sustancia, en una muestra, que comprende:

(a) un suministro de un compuesto marcador fluorescente;

(b) un recipiente de reacción adaptado para mantener una cantidad del compuesto marcador fluorescente y una muestra de análisis, que juntos experimentan una reacción comenzando en el momento t0 y finalizando en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con el compuesto marcador que altera las características de fluorescencia de compuesto marcador;

(c) una fuente de radiación electromagnética que tiene una longitud de onda λn para excitar la fluorescencia en el compuesto marcador;

(d) medios de detección para medir la fluorescencia resultante en múltiples puntos temporales mientras progresa la reacción; y

(e) un procesador adaptado para calcular de la fluorescencia medida los valores de F0 siendo la fluorescencia

en el momento t0, y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia ha reaccionado con el compuesto marcador; para calcular cualquier cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción entre la sustancia y el compuesto marcador; y para determinar de esos valores calculados la cantidad y/o concentración de la sustancia no fluorescente y/o una subespecie de la misma presente en la muestra en el momento t0.

13. Un aparato como se reivindica en la reivindicación 12, que está adaptado para recibir una muestra derivada sanguínea y para realizar un análisis para determinar la cantidad de hemoglobina glicosilada.

14. Un método de determinar la concentración de una sustancia no fluorescente, que comprende excitar un 45 reactivo fluorescente concordante, el espectro de excitación y de emisión del cual se superpone al espectro de absorción de la sustancia no fluorescente; detectar la fluorescencia resultante; añadir la sustancia no fluorescente al reactivo fluorescente concordante de tal forma que la sustancia reaccione con el reactivo fluorescente para alterar la fluorescencia a lo largo del tiempo; detectar un intervalo de los valores de fluorescencia durante un periodo de tiempo comenzando al menos 5 segundos después de la adición; usar el intervalo de valores de fluorescencia medidos para extrapolar un valor para la fluorescencia directamente tras la adición de la sustancia en el momento t0; y calcular la concentración de la sustancia no fluorescente de la diferencia entre la fluorescencia detectada antes y después de la adición de la sustancia no fluorescente.