ALELOS DEL GEN OPCA DE BACTERIAS CORINEFORMES.

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen,

que codifica el polipéptido glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, realizándose que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se escoge entre el conjunto que se compone de a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina, b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/062010.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11 45128 ESSEN ALEMANIA.

Inventor/es: THIERBACH, GEORG, BATHE, BRIGITTE, DR., SCHISCHKA,Natalie.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 3 de Mayo de 2006.

Clasificación PCT:

  • C07K14/34 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Corynebacterium (G).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.

PDF original: ES-2374837_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Son objeto del invento mutantes y alelos del gen opcA, que codifican variantes de la subunidad OpcA de la glucosa- 6-fosfato-deshidrogenasa (EC: 1.1.1.49) y unos procedimientos para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano mediando utilización de bacterias, que contienen estos alelos. Estado de la técnica Los aminoácidos encuentran utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y en particular en la nutrición de animales. Es conocido el hecho de que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de esto, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como por ejemplo la agitación y el abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho. Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a los antimetabolitos o que son auxótrofas para los metabolitos importantes en regulación y que producen aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC). Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácidos, que consisten en que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de los aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos. Una representación recopilativa acerca de los aspectos más diversos de la genética, del metabolismo y de la biotecnología de Corynebacterium glutamicum se encuentra en la cita de Pühler (coordinador principal de edición) en: Journal of Biotechnology 104: (1-3), 1-338, 2003. Moritz y colaboradores (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000)) informan acerca de investigaciones fisiológicas y bioquímicas en la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum. De acuerdo con las investigaciones de Moritz y colaboradores, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se compone de una subunidad Zwf y de una subunidad OpcA. Un método para la determinación de la actividad enzimática de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se ha descrito en la cita de Moritz y colaboradores (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000). La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la subunidad OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum, está generalmente disponible, entre otros lugares, en el banco de datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información de biotecnología) (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.). de la National Library of Medicin (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número AX121828. Ella se puede tomar además de la solicitud de patente europea EP1108790 como la secuencia n° 1744. Se pueden aprovechar asimismo otros bancos de datos, tales como, por ejemplo, el banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (Laboratorios europeos de biología molecular) (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino Unido) o el del Swiss Institute of Bioinformatics (Instituto suizo de bioinformática) (Swissprot, Ginebra, Suiza) o de la Protein Information Resource Database (Base de datos de recursos de información sobre proteínas) (PIR, Washington DC, EE.UU.). La biosíntesis microbiana de L-aminoácidos en bacterias corineformes es un sistema complejo y está entrelazada en múltiples aspectos con otras diversas rutas metabólicas en la célula. Por ello, no se puede realizar ninguna predicción sobre si el polipéptido OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se modifica por mutación de tal manera que se mejore la producción de L-aminoácidos. Para el mejor carácter sinóptico, la secuencia de nucleótidos del gen zwf (gen de tipo silvestre) que codifica la subunidad OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum, se representa de acuerdo con los datos del banco de datos del NCBI en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa codificada, que se establece a partir de ésta, se representa en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican adicionalmente unas secuencias de nucleótidos, que están situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream"). Misión del invento Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unas cepas mejoradas de 2 E06777211 30-12-2011   microorganismos, que produzcan unas cantidades aumentadas de aminoácidos, en particular de L-lisina y Ltriptófano. Descripción del invento Son objeto del invento unos mutantes de bacterias corineformes, producidos in vitro y/o in vivo, o respectivamente aislados, que segregan de manera preferida ciertos aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que codifica la subunidad OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, siendo escogida la secuencia de aminoácidos del polipéptido entre el conjunto que se compone de a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina, b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones. El polipéptido, que está contenido en los mutantes conformes al invento, puede ser designado asimismo como polipéptido OpcA, polipéptido OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, como subunidad OpcA de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa, o como subunidad de polipéptido OpcA. En el documento EP 1 108 790 (véase la SEQ ID NO: 1744 en la Tabla 1) el polipéptido OpcA es designado también como proteína de ensamblaje de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa (en inglés "glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly protein"). En el caso de las bacterias corineformes se prefiere el género Corynebacterium. Se prefieren especialmente unas cepas que segregan aminoácidos, que se basan en las siguientes especies: Corynebacterium efficiens, tal como por ejemplo la cepa DSM44549, Corynebacterium glutamicum, tal como, por ejemplo, la cepa ATCC13032, Corynebacterium thermoaminogenes, tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539, y Corynebacterium ammoniagenes, tal como, por ejemplo, la cepa ATCC6871, prefiriéndose muy especialmente la especie Corynebacterium glutamicum. Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos a partir del estado de la técnica también bajo otras denominaciones de especies. A estas pertenecen, por ejemplo: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y Brevibacteritium divaricatum ATCC14020. Unos representantes conocidos de cepas de bacterias corineformes, que segregan aminoácidos, son, por ejemplo, las cepas que producen L-lisina Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) descrita en el documento de patente europea EP 0 358 940, Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrita en la cita de Menkel y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)), Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382)) descrita en el documento EP 1 108 790, Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474, descrita en el documento de patente de los EE.UU. US 4.275.157, Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrita en el documento US 5.250.423, o las cepas que producen L-triptófano 3 E06777211 30-12-2011   Corynebacterium glutamicum K76 (= FermBP-1847) descrita en el documento US 5.563.052, Corynebacterium glutamicum BPS13 (= FermBP-1777) descrita en el documento US 5.605.818, y Corynebacterium glutamicum FermBP-3055, descrita en el documento US 5.235.940. Se encuentran datos sobre la clasificación taxonómica de las cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology, 129, 1433-1477 (1983)), de Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica el polipéptido glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, realizándose que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se escoge entre el conjunto que se compone de a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina, b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones. 2. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados porque en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria que se escoge entre el conjunto que se compone de Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, y Corynebacterium aminogenes. 3. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizados porque se trata de Corynebacterium glutamicum. 4. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizados porque se trata de bacterias que segregan L-aminoácidos. 5. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizados porque se trata de bacterias corineformes que segregan L-lisina o L-triptófano. 6. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizados porque el gen abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3, y de un segundo cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3. 7. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizados porque el gen abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 8. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 7, caracterizados porque el gen abarca la secuencia de nucleótidos, que es idéntica en un 100 % a la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 9. Polinucleótido aislado, que codifica el polipéptido de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, realizándose que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se escoge entre el conjunto que se compone de a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina, b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones. 10. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque es idéntico a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que se obtiene mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de 56 E06777211 30-12-2011   cebadores, que se compone de un primer cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3, y de un segundo cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos que se escogen a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos situada entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3. 11. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5, comprendiendo las condiciones rigurosas una etapa de lavado con un tampón que corresponde a 2xSSC a una temperatura de 52°C a 68°C. 12. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, estando el polinucleótido caracterizado porque abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 13. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 96 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5. 14. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se abarcan las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 15. Polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos que corresponde a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6. 16. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque contiene una o varias mutaciones mudas. 17. Polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque abarca por lo menos la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 292 hasta 810 de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 18. Un microorganismo recombinante, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 9 hasta 17, o que se había producido mediante su utilización. 19. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia coli. 20. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Corynebacterium. 21. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque en el caso de la bacteria del género Corynebacterium se trata de la especie Corynebacterium glutamicum. 22. Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 9 hasta 17. 23. Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 22. 24. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia. 25. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Corynebacterium. 26. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque en el caso de la bacteria del género Corynebacterium se trata de la especie Corynebacterium glutamicum. 27. Bacteria corineforme recombinante, que contiene en su cromosoma un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, realizándose que se sobreexpresa el mencionado polinucleótido mediante unión con un promotor. 28. Procedimiento para la producción de un L-aminoácido, caracterizado porque se fermenta una bacteria corineforme aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, 18-21, 23-27 en un medio adecuado. 29. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque se aísla o recoge el L-aminoácido deseado. 30. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque se purifica el L-aminoácido deseado. 57 E06777211 30-12-2011   31. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 28 hasta 30, caracterizado porque el L-aminoácido deseado se aísla o se recoge en común con los componentes del caldo de fermentación y/o con la biomasa (> 0 a 100 %). 32. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque a) la biomasa se elimina a partir del caldo de fermentación en una proporción de 0 a 100 %, y b) a partir del caldo obtenido de esta manera se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método que se escoge entre el conjunto que se compone de granulación, compactación, desecación por atomización y extrusión. 33. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque, antes o después de la etapa a), al caldo de fermentación se le añade un ácido que se escoge entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico. 34. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque a partir del caldo, que se ha obtenido antes o después de la etapa a), se elimina el agua. 35. Procedimiento de acuerdo con la etapa 32, caracterizado porque el producto conformado obtenido en o durante la etapa b) es rociado con un aceite. 36. La cepa DM 1825 de Corynebacterium glutamicum depositada bajo el n° DSM 17223 en la DSMZ (Braunschweig). 58 E06777211 30-12-2011   Figura 1: Plásmido pCRII_opcAaa4ex 59 E06777211 30-12-2011   Figura 2: Plásmido pK18mobsacB_opcAaa4ex E06777211 30-12-2011

 

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