Aislamiento de células.

Método para aislar condrocitos de una muestra de tejido cartilaginoso que comprende:

(a) someter la muestra de tejido a una enzima de digestión, usando opcionalmente diferentes enzimas secuencial o simultáneamente, durante un periodo de 5 minutos a 1 hora, y

(b) recoger los condrocitos aislados en la etapa (a) mediante la separación de los condrocitos de la enzima de digestión, terminando así eficazmente el proceso de digestión;

en el que en la etapa (a) se usa colagenasa y en el que el tiempo de aislamiento total es menor de 2 horas.

Aislamiento de células La invención se refiere a un método para aislar células de una muestra de tejido.

Los trastornos cartilaginosos son trastornos altamente debilitantes que incluyen, por ejemplo, traumatismo cartilaginoso articular, lesión de menisco, trastornos condrogenéticos y artritis. No existen actualmente terapias óptimas disponibles para tratar estos trastornos. El tejido cartilaginoso no está inervado ni penetrado por los sistemas vascular ni linfático, y se cree generalmente que, debido a esta falta de vasos, el tejido cartilaginoso dañado no recibe estímulos suficientes o apropiados para desencadenar una respuesta de reparación. La reparación de articulaciones artríticas requiere por tanto cirugía ortopédica para reemplazar las articulaciones desgastadas por una prótesis o por un injerto biológico. Particularmente, la artritis es un problema médico y económico enorme.

Los enfoques actuales para reparación de cartílago se basan en la retirada de los restos de tejido, el acceso al sistema de curación de heridas del hueso penetrando la placa ósea subcondrial y el transplante de tejido y terapias basadas en células. Las terapias clínicas actuales implican típicamente células autólogas. Son ejemplos de dichas terapias la implantación de condrocitos autólogos (ICA) y la mosaicoplastia (también conocida como injerto osteocondral autólogo) . Debido a sus grandes inconvenientes, ambas terapias pueden dirigirse solo a una parte limitada del mercado de reparación de cartílago Para la mosaicoplastia, la desventaja principal es la limitación a defectos pequeños debido a la disponibilidad limitada de tejido de donante para transplante. Para la ICA, los inconvenientes incluyen la necesidad de efectuar dos operaciones quirúrgicas, una para recoger tejido cartilaginoso, y otra para la implantación de los condrocitos propagados in vitro obtenidos del tejido cartilaginoso recogido. Aparte del hecho de estar implicados costes altos, el proceso de ICA es largo, puesto que es necesaria la propagación celular in vitro durante la cual las células cartilaginosas se desdiferencian y pierden su fenotipo. Por ello, es necesaria una larga rehabilitación de varios meses después del procedimiento de implantación quirúrgica para que las células recuperen su fenotipo original. Solo entonces puede empezar la verdadera reparación de cartílago.

Recientemente, se ha desarrollado una ICA de segunda generación que implica condrocitos autólogos en una matriz de biomaterial. Esta técnica resuelve algunos de los problemas de la ICA, particularmente el procedimiento quirúrgico largo y abierto que era necesario en ICA. Sin embargo, permanecen inconvenientes importantes: tienen que llevarse a cabo procedimientos quirúrgicos que implican altos costes y una larga rehabilitación. Una de las razones por las que tienen que llevarse a cabo dos procedimientos quirúrgicos es que los procesos actuales para aislar condrocitos de una muestra de tejido extraída del paciente llevan mucho tiempo.

El cartílago hialino, la forma más abundante de cartílago, es de suavidad cristalina, brillante y de apariencia blanca azulada, y de esta forma de cartílago, el cartílago articular es el más común. El cartílago articular cubre los extremos de los huesos largos de las articulaciones sinoviales. Se caracteriza por una organización estructural particular, consistente en condrocitos embebidos en un material extracelular, designado típicamente como "matriz cartilaginosa", que es una matriz extracelular rica en proteoglucanos, fibrillas de colágeno, otras proteínas y agua. Los condrocitos son el único tipo celular encontrado en cartílago articular normal, pero contribuyen con menos de un 2% al peso húmedo del tejido cartilaginoso adulto sano humano.

La matriz extracelular del tejido cartilaginoso consiste predominantemente en moléculas de proteoglucano específicas de cartílago con cadenas laterales de glucosaminoglucano (GAG) sulfatadas altamente cargadas negativamente, así como fibrillas de colágeno de tipo II. Las cadenas laterales de GAG pueden unirse a moléculas de agua, secuestrando así el agua y generando una presión de hinchamiento interna dentro de la matriz cartilaginosa. Estas propiedades de tipo hidrogel son esenciales para los patrones de flujo del fluido intersticial observados dentro de la matriz durante la carga funcional del cartílago, en cuyo punto se expulsa el agua del tejido en una cantidad que permite a las cadenas de GAG cargadas negativamente repelerse entre sí. Tras la liberación de la carga compresiva, se vuelve a embeber agua en la matriz de tejido. La red colagenosa, junto con los GAG unidos por agua, posibilita al cartílago articular soportar grandes cargas compresivas, lo que da al tejido su función única en articulaciones sinoviales: una articulación suave e indolora, una distribución de la carga aplicada sobre el hueso subcondrial y la absorción de los choques mecánicos.

En tejido cartilaginoso normal, los proteoglucanos se recambian lenta pero continuamente, las moléculas degradadas se liberan del cartílago y se reemplazan por componentes recién sintetizados. Es el control coordinado de la síntesis y degradación de los componentes de la matriz por los condrocitos lo que mantiene el cartílago normal.

Después de extraer una muestra de tejido del cartílago del paciente, los condrocitos presentes en esa muestra tienen que aislarse de la matriz extracelular antes de que puedan propagarse e implantarse con el objetivo de reparar un defecto de tejido cartilaginoso. La liberación enzimática de las células localizadas en la matriz extracelular requiere la difusión de la enzima al sustrato (por ejemplo, colágeno) , la digestión del colágeno y la liberación de las células.

Los procedimientos conocidos para el aislamiento de condrocitos se llevan a cabo incubando una muestra de tejido cartilaginoso con una disolución de colagenasa durante un periodo de 16 a 22 horas. La creencia actual es que tiempos de incubación más cortos no producen suficientes rendimientos celulares con fines de propagación y reparación de te jido, mientras que se cree que una exposición más larga a colagenasa compromete la viabilidad celular. El tiempo de incubación más corto descrito en la materia parece ser de 2 horas (Jakob et al., Connective Tissue Research, 44 (2003) , 173-180) . La digestión nunca terminaba antes de 2 horas.

La presente invención proporciona un método para aislar condrocitos de una muestra de tejido cartilaginoso que es considerablemente más corto que los métodos de la técnica anterior. Por tanto, al contrario que los procedimientos de aislamiento conocidos, puede completarse un método para aislar condrocitos según la invención en la duración habitual de un procedimiento quirúrgico para reparar un defecto cartilaginoso. Los procedimientos quirúrgicos para tratamientos de defectos cartilaginosos duran habitualmente entre 30 y 90 minutos. Sorprendentemente, se ha mostrado ahora que puede aislarse un número sustancial y suficiente de células al cabo de 30 minutos o incluso 10 minutos.

La opinión actual en la materia es que se requiere un alto número de condrocitos para uso en la reparación de defectos cartilaginosos: típicamente al menos 1 millón de condrocitos para la reparación de un defecto que tenga un volumen de 1 ml. Sorprendentemente, se ha mostrado ahora que números de células menores de 1 millón de condrocitos pueden ser suficientes para aplicar a un defecto de tejido cartilaginoso de un volumen de 1 ml y conseguir la formación de cartílago.

La presente invención se refiere por tanto a un método para aislar condrocitos de una muestra de tejido cartilaginoso como se define en la reivindicación 1.

En una realización preferida, los condrocitos se aíslan de una muestra de cartílago articular, por ejemplo, para la reparación de defectos cartilaginosos.

Antes de someter la muestra de tejido a la enzima de digestión, un método según la invención puede comprender triturar la muestra de tejido para obtener fragmentos menores del tejido, preferiblemente de aproximadamente 0, 5 a 2 mm de diámetro, más preferiblemente de aproximadamente 1 mm. La trituración puede efectuarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo usando tijeras, una o más cuchillas (puede usarse un conjunto de cuchillas paralelas para hacer cortes, o pueden usarse dos de dichos conjuntos para hacer cubos) , un escalpelo, filtrando a través de una criba o tamiz de malla de acero o nailon, o disgregando a través de una aguja.

En una realización preferida, se... [Seguir leyendo]

1. Método para aislar condrocitos de una muestra de tejido cartilaginoso que comprende:

(a) someter la muestra de tejido a una enzima de digestión, usando opcionalmente diferentes enzimas secuencial o simultáneamente, durante un periodo de 5 minutos a 1 hora, y (b) recoger los condrocitos aislados en la etapa (a) mediante la separación de los condrocitos de la enzima de digestión, terminando así eficazmente el proceso de digestión;

en el que en la etapa (a) se usa colagenasa y en el que el tiempo de aislamiento total es menor de 2 horas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de tejido se somete a la enzima de digestión durante un periodo de 10 a 30 minutos.

3.Método según la reivindicación 1 o 2, en el que el cartílago es cartílago articular.

4.Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima de digestión se elige del grupo consistente en colagenasas, pronasas, dispasas, tripsinas, hialuronidasas, condroitinasas, elastasas y heparitinasas.

5.Método según la reivindicación 4, en el que la enzima de digestión es colagenasa de tipo II.

6.Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los condrocitos aislados se recogen 15 mediante filtración, lavado, centrifugación y/o extracción con perlas magnéticas.

7.Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra de tejido se somete a un tratamiento para aumentar la permeabilidad de la matriz extracelular antes de someterla a la enzima de digestión, en el que el tratamiento para aumentar la permeabilidad de la matriz extracelular comprende poner en contacto la muestra de tejido con un ácido, una base, dimetilsulfóxido, catepsina, glicerol o cationes.

Figura 1

Figura 2

Figura 3