Uso de un vector retroviral, que comprende regiones cPPT y CTS de origen lentiviral en el que la LTR se deleciona para el promotor y potenciador de U3,

para aumentar in vitro la tasa de importación, de una secuencia de ácido nucleico contenida en dicho vector, en el núcleo de una célula huésped.

ADN de triple hélice lentiviral, y vectores y células recombinantes que contienen ADN de triple hélice lentiviral

5 Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, y especialmente a ácidos nucleicos virales y células

que contienen ácidos nucleicos virales. Más particularmente, la presente solicitud describe secuencias de ácido nucleico virales que pueden formar parte de de estructuras de ADN de triple hélice así como de vectores de ácidos nucleicos, virus, y células que contienen estas secuencias de ácido nucleico virales. La presente invención se refiere, además, a métodos de uso de dichas estructuras de ADN y secuencias de ácido nucleico.

15 Descripción de la técnica relacionada

La transferencia génica en células madre hematopoyéticas (CMH) tiene un gran potencial, tanto para la terapia génica de enfermedades congénitas así como adquiridas, como para el entendimiento de mecanismos que regulan la hematopoyesis normal y patológica. Dado que las CMH tienen grandes capacidades de proliferación, la 20 transferencia génica estable debe incluir la integración genómica del transgén. Los retrovirus basados en virus de la leucemia murina de Moloney (VLMMo) han sido muy populares, dado que se integran en los genomas de las células huésped y pueden permitir la expresión transgénica a largo plazo. Sin embargo, estos oncorretrovirus no se integran en células que no se dividen, y la mayoría de las CMH están inactivas. Se han desarrollado muchos protocolos previos a estimulación usando diferentes asociaciones de citoquinas para desencadenar el ciclo de las CMH con el 25 fin de convertirlas en transducibles mediante vectores de transferencia de genes dependientes de mitosis derivados de oncovirus. Sin embargo, la estimulación de citoquinas induce la diferenciación junto con la proliferación y podrían perderse potencialidades de las CMH durante el proceso de transducción. Este problema puede superarse mediante el uso de vectores derivados de lentivirus, dado que se ha demostrado que los lentivirus infectan tanto a las células que se dividen como a las que no se dividen (Poznansky et al., 1991; Naldini et al., 1996) . Informes iniciales

publicados en los tres últimos años usando dichos vectores derivados de lentivirus para la transducción de las CMH mostraron resultados prometedores pero muy heterogéneos (Case et al., 1999; Evans et al., 1999; Uchida et al., 1998; Miyosi et al., 1999) .

Los lentivirus han desarrollado una estrategia de importación nuclear que permite a su genoma de ADN atravesar la

membrana nuclear de una célula huésped. Esta importación nuclear activa de los lentivirus explica su capacidad única, entre los retrovirus, para replicarse eficazmente en células diana que no se dividen, tales como macrófagos tisulares. La restricción de la replicación de oncovirus tales como VLMMo a células que se dividen parece deberse al requisito de la ruptura de la barrera de la membrana nuclear durante la mitosis, permitiendo a los complejos de preintegración (PIC) de VLMMo entrar en el núcleo (Roe et al., 1993) . La replicación de lentivirus independiente de

mitosis, en el origen de su estrategia de replicación in vivo y por tanto de su patogenicidad, ha permitido también la generación de vectores de transferencia génica lentivirales con aplicaciones terapéuticas prometedoras (Poznansky et al., 1991; Naldini et al., 1996) .

La replicación independiente de mitosis de lentivirus fue demostrada por primera vez mediante la infección

45 productiva de células condroides no mitóticas mediante el lentivirus VISNA (Thormar, 1963) . Pronto tras su descubrimiento, el VIH demostró replicarse en macrófagos primarios diferenciados (Gartner et al., 1986; Ho et al., 1986) . El ADN del VIH se integra en la cromatina de células diana no mitóticas (Weinberg et al., 1991; Lewis et al., 1992) , lo que implica que los PIC del VIH-1 pueden atravesar la membrana nuclear de las células huésped (Bukrinsky et al., 1992) . De este modo, la importación nuclear independiente de mitosis es un suceso fundamental

50 responsable de la capacidad de los lentivirus para replicarse en células que no se dividen.

La búsqueda de determinantes virales responsables de la importación nuclear activa del genoma de ADN del VIH-1 ha constituido un campo de investigación activo pero controvertido. La presencia de supuestas señales de localización nucleares (NLS, nuclear localization signals) dentro de la matriz (MA) y proteínas virales Vpr ha 55 conducido a la proposición de que éstas podrían actuar de una manera redundante en la importación nuclear de ADN de VIH-1 (Burkinsky et al., 1993b; Emerman et al., 1994; Popov et al., 1998; von Schwedler et al., 1994) . Se ha propuesto que la fosforilación de un pequeño subconjunto (1%) de moléculas de la MA en un resto de tirosina Cterminal activa su liberación de la membrana plasmática y su asociación con la proteína integrasa del VIH-1 (Gallay et al., 1995a; 1995b) . La aportación de estas proteínas a las propiedades cariofílicas de los PIC del VIH es

60 actualmente un asunto de un controvertido debate (Freed y Martin, 1994; Freed et al., 1995; Fouchier et al., 1997; Freed et al., 1997; Koostra y Schuitemaker, 1999) . Más recientemente, se han identificado motivos de NLS en la proteína integrasa (IN) y se ha descrito que mutaciones de estos motivos suprimen la interacción de IN con carioferina α, un receptor de NLS celular (Gallay et al., 1997) .

Sea cual sea el papel de estas proteínas virales candidatas en la importación nuclear del VIH, la presente invención muestra que el propio genoma de VIH-1 retrotranscrito lleva un determinante que actúa en posición cis para su 5 importación nuclear.

La invención proporciona un ácido nucleico que comprende una estructura (triple hélice) de triple cadena, tal como una de un lentivirus. La triple hélice estimula la entrada de ácidos nucleicos en el núcleo de las células. El ácido nucleico puede contener las secuencias que actúan en posición cis cPPT y CTS de un lentivirus. El lentivirus puede ser cualquier lentivirus, incluyendo, aunque sin limitarse a, VIH-1, VIH-2, VISNA, VAIE, VIF, y AEC. En realizaciones, el ácido nucleico está en el contexto de un vector, tal como un vector de expresión.

Por lo tanto, la solicitud también describe un vector, por ejemplo, un vector de ácido nucleico. El vector de ácido nucleico puede incluir secuencias de cualquier vector conocido por el especialista en la técnica como útiles para la

transferencia de ácidos nucleicos al interior de células o para la expresión de ácidos nucleicos in vivo o in vitro.

La solicitud describe además virus y células (eucariotas y procariotas) que contienen el ácido nucleico descrito en este documento. Las células pueden ser células recombinantes.

La solicitud describe adicionalmente un método de transferencia de ácidos nucleicos a un núcleo de célula huésped, por ejemplo, exponiendo la célula huésped al ácido nucleico, vector, virus o célula de la invención, para proporcionar una célula recombinante. Este método permite la transferencia de alta eficacia de ácidos nucleicos al núcleo de la célula huésped, tal como el núcleo de una célula madre hematopoyética. La transferencia de alta eficacia permite al especialista en la técnica poner en práctica diversos métodos de tratamiento, incluyendo, aunque sin limitarse a,

métodos de tratamiento profiláctico, métodos de tratamiento de mejora y métodos de tratamiento curativo. Por ejemplo esta invención permite métodos de terapia génica. En general, la terapia génica puede usarse para tratar enfermedades sanguíneas, enfermedades del cerebro, enfermedades víricas así como muchas otras enfermedades congénitas y adquiridas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra que la iniciación central de la transcripción inversa es una etapa importante en el ciclo de replicación del VIH-1.

(A) Mutaciones introducidas en la secuencia cPPT del VIH-1. Se construyeron virus mutantes cPPT conservativos y semiconservativos. El mutante semiconservativo cPPT-D contiene 10 mutaciones en el cPPT 19-mero. El mutante cPPT-AG es su virus control en el que una única mutación purina a purina introduce el mismo cambio de aminoácidos en la región... [Seguir leyendo]

1. Uso de un vector retroviral, que comprende regiones cPPT y CTS de origen lentiviral en el que la LTR se

deleciona para el promotor y potenciador de U3, para aumentar in vitro la tasa de importación, de una secuencia de 5 ácido nucleico contenida en dicho vector, en el núcleo de una célula huésped.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector retroviral es un vector lentiviral.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho vector lentiviral es un vector derivado de VIH.

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho vector retroviral es un vector de expresión o un vector de integración.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector retroviral es un vector de 15 sustitución en el que todas las secuencias codificantes retrovirales entre las LTR están delecionadas.

6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un péptido, polipéptido o proteína.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica una

proteína terapéutica. 25

9. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha célula es una célula eucariota.

10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha célula es una célula que se divide o una célula que no se divide.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el que dicha célula es una célula de mamífero, siempre que dicha célula no sea una célula germinal humana.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha célula es una célula hematopoyética, tal como una 35 célula madre hematopoyética.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el que dicha célula es un derivado de una célula como se define en la reivindicación 11 ó 12.

14. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dichas regiones cPPT y CTS se originan a partir de VIH, tal como virus VIH-1 o VIH-2, VISNA, VAIE, VIF o AEC.

15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el porcentaje de células expuestas

al ácido nucleico contenido en el vector retroviral que captan dicho vector en su núcleo es superior al 30%, 45 preferiblemente superior al 50% y más preferiblemente superior al 80%.

16. Un vector retroviral, que comprende regiones cPPT y CTS de origen lentiviral y una LTR de origen retroviral con el promotor y potenciador de su región U3 delecionados, para su uso para aumentar la tasa de importación de un ácido nucleico contenido en dicho vector, en el núcleo de una célula huésped, para tratar a dicho huésped.

17. Un vector retroviral de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho vector retroviral es un vector lentiviral.

18. Un vector lentiviral de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho vector lentiviral es un vector derivado de

VIH. 55

19. Un vector retroviral o lentiviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que es un vector de expresión o un vector de integración.

20. Un vector retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que es un vector de sustitución en el que todas las secuencias codificantes retrovirales entre las LTR están delecionadas.

21. Un vector retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

65 22. Un vector retroviral de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un péptido, polipéptido o proteína.

23. Un vector retroviral de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica una proteína terapéutica.

24. Un vector retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicha célula es una 5 célula eucariota.

25. Un vector retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicha célula es una célula que se divide o una célula que no se divide.

26. Un vector retroviral de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, en el que dicha célula es una célula de mamífero, siempre que dicha célula no sea una célula germinal humana.

27. Un vector retroviral de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicha célula es una célula hematopoyética, tal

como una célula madre hematopoyética. 15

28. Un vector retroviral de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, en el que dicha célula es un derivado de una célula como se define en la reivindicación 26 ó 27.

29. Un vector retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 28, en el que dichas regiones 20 cPPT y CTS se originan a partir de VIH, tales como virus VIH-1 o VIH-2, VISNA, VAIE, VIF o AEC.

30. Un vector retroviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29, en el que el porcentaje de células expuestas al ácido nucleico contenido en el vector que captan dicho vector en su núcleo es superior al 30%, preferiblemente superior al 50% y más preferiblemente superior al 80%.

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