VECTORES Y USOS DEL TRANSPOSON MBOUMAR.
Vectores y usos del transposon Mboumar.Producción de una transposasa naturalmente activa de Messor bouvieri de forma recombinante,
construcciones genéticas derivadas del transposon Mboumar necesarias para la transgénesis y mutagénesis, y usos de las mismas
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800593.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE JAEN.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: JAÉN.
Inventor/es: CARRILLO AVILA,JOSE ANTONIO, MUÑOZ LOPEZ,MARTIN, PALOMEQUE MESSIA,TERESA AMALIA, LORITE MARTINEZ,PEDRO.
Fecha de Solicitud: 29 de Febrero de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 17 de Enero de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/52 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
- C12N9/22 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Ribonucleasas.
Clasificación PCT:
Fragmento de la descripción:
Vectores y usos del transposon Mboumar.
La presente invención se incluye en el área de biología molecular, concretamente dentro de la genética molecular, y más concretamente en el campo de estudio de los elementos genéticos móviles o transposones. Se refiere a los vectores necesarios para la construcción de herramientas genéticas basados en los transposones, y a los usos de los mismos.
Estado de la técnica anterior
Los transposones son secuencias de ADN que pueden moverse a diferentes posiciones dentro del genoma de una célula, un proceso denominado tranposición. En general se clasifican en dos grupos:
Las transposasas son las enzimas responsables de su movilidad y son sintetizadas por el propio transposon. In vivo pueden originar transposición de material genético dentro de un mismo cromosoma, entre cromosomas, e incluso entre cromosomas y material genético no cromosómico como, por ejemplo, ADN mitocondrial. Este movimiento de material genético puede originar graves disturbios en el organismo en que se produce, aunque también se sabe que ha tenido una gran importancia a lo largo de la evolución. En un principio los transposones se consideraron como "ADN basura". Sin embargo, actualmente se piensa que pueden influir en el genoma hospedador de diferentes maneras. Así, se considera que pueden modular la expresión génica actuando como promotores, activadores, silenciadores, sitios de procesamiento alternativo o sitios indicativos de modificaciones epigenéticas. Igualmente, pueden contener genes que podrían ser incluidos en el genoma del huésped para la realización de una función celular determinada, proceso que se conoce como "domesticación molecular". Además de todo lo anterior, debido a su existencia en copias múltiples pueden actuar como sitios de recombinación originando en el genoma duplicaciones, inversiones, deleciones o translocaciones. (Charlesworth et al. 1994. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature 371: 215-220; Kidwell MG. 2002. Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes. Genetica 115: 49-63; Ivics & Izsvak 2004. Transposable elements for transgenesis and insertional mutagenesis in vertebrates: a contemporary review of experimental strategies. Methods Mol Biol 260: 255-276.) Recientes observaciones demuestran que los transposones pueden ser activos en células somáticas, abriendo la posibilidad de que puedan jugar un importante papel generando diversidad entre células con un mismo genoma. Concretamente, se ha considerado que esta diversidad podría ser generada por cambios en la regulación de la expresión de la transposasa que a su vez, podría afectar la regulación de la expresión génica de ciertos genes en determinadas células. Los efectos podrían ser beneficiosos (como ocurre probablemente en los casos de diferenciación de células neuronales, o en la actividad de las proteínas RAG, importantes en los procesos de recombinación que ocurren en el genoma de los linfocitos) o deletéreos (procesos cancerígenos) dependiendo del momento del desarrollo y del tipo celular (Collier and Largaespada. Transposable elements and the dynamic somatic genome. Rewied. 2007. Genome Biology 2007, 8 (Suppl 1: S5).
Los transposones del tipo mariner son secuencias capaces de moverse por el genoma que se encuentran flanqueadas por secuencias repetidas terminales invertidas (inverted terminal repeats ó ITRs). Codifican una única proteína, la transposasa, que uniéndose a esas ITRs escinde el mariner y lo integra en otro lugar del genoma. La transposasa Mos1 cataliza el movimiento del transposón Mos1 encontrado en Drosophila mauritania, el cual es, no sólo el primer elemento mariner aislado, sino también el primer elemento mariner aislado activo de forma natural. Los elementos mariner constituyen una numerosa familia de transposones ampliamente extendidos en el reino animal. Codifican la enzima transposasa que es el único requerimiento para su transposición. Esta enzima tiene dos dominios: el dominio N-terminal o dominio de unión al DNA y el dominio C-terminal o dominio catalítico, el cual conserva el motivo DD(34)D. En esta enzima se han identificado además otros motivos y dominios imprescindibles para su actuación. A pesar de lo mencionado, aún hay aspectos desconocidos de su actuación, cuyo conocimiento podría proporcionar grandes ventajas para su uso como vectores, además de proporcionar interesantes datos científicos; por este motivo en los últimos años se están realizando numerosos estudios en este sentido.
La amplia distribución de los elementos mariner, presentes también en humanos, y su, aparentemente, fácil transferencia horizontal entre distintos grupos de animales, implica que son capaces de funcionar en diferentes ambientes celulares, es decir, no requieren factores específicos del hospedador para llevar a cabo su transposición. Estos hechos han llevado a la realización de una serie de estudios para conseguir un vector de amplio uso en células animales. Sin embargo, la mayor parte de los elementos mariner que se han clonado hasta el momento son defectivos, ya que han sufrido mutaciones en la región codificante de la transposasa, por lo que son incapaces de producir transposasas funcionales, motivo que ha originado que los transposones usados actualmente como vectores sean mayoritariamente derivados de construcciones realizadas en el laboratorio, usando secuencias consenso. Esto parece deberse a un proceso denominado "inactivación vertical" (Lohe et al., 1995. Horizontal transmission, vertical inactivation, and stochastic loss of mariner-like transposable elements. Mol. Biol. Evol. 12: 62 72). Aunque estos elementos son inactivos de forma natural (al menos respecto su función transposasa), conservan relativamente su estructura, existiendo varias hipótesis al respecto. Así, puede que los elementos inactivos tengan algún efecto regulatorio, o que provengan de la introgresión reciente de un genoma a otro.
La importancia del uso de vectores basados en transposones en campos tan diversos como el estudio de genes implicados en el cáncer, en la generación de modelos de enfermedades humanas en ratón, en la generación de cerdos transgénicos con posibilidad de utilización como granjas farmacéuticas, en la regulación génica y diferenciación celular, en estudios de genómica funcional etc., ha llevado a la realización de numerosas investigaciones con estos vectores utilizados en diferentes organismos y en diferentes condiciones.
Se han desarrollado herramientas de transposición in vivo en varios organismos. (En la tabla 1 se expone un resumen). En la mayoría de los casos, hospedadores específicos requerían vectores especiales.
Las reacciones de transposición in vivo se llevan a cabo con independencia de las condiciones celulares o del hospedador: Generalmente se llevan a cabo con transposasas purificadas, y como dianas se pueden emplear plásmidos, fragmentos génicos, o ADN genómico aislado. En reacciones sucesivas, los plásmidos que contienen los transposones pueden ser transferidos a células hospedadoras.
La transposición in vitro ofrece muchas ventajas sobre los sistemas in vivo (Devine and Boeke 1994. Efficient integration of artificial transposons into plasmid targets in vitro: a useful tool for DNA mapping, sequencing and genetic analysis. Nucleic Acids Res, 22: 3765-3772; Biery et al. 2000. A simple in vitro Tn7-based transposition system with low target site selectivity for genome and gene analysis. Nucleic Acids Res, 28: 1067-1077), principalmente se puede evitar la interferencia con factores del hospedador. Las reacciones de transposición in vitro son, generalmente, más eficientes y más flexibles en la elección de las dianas en el ADN (Goryshin and Reznikoff. 1998. Tn5 in vitro transposition. J Biol Chem, 273: 7367-7374)....
Reivindicaciones:
1. Péptido recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.
2. Péptido recombinante según la reivindicación 1 cuya secuencia de aminoácidos presenta, al menos, una identidad del 70% con la SEQ ID NO: 1.
3. Péptido recombinante según la reivindicación 1 que presenta una identidad de, al menos, un 80% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
4. Péptido recombinante según la reivindicación 1 que presenta una identidad de, al menos, un 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
5. Péptido recombinante según la reivindicación 1 que presenta una identidad de, al menos, un 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
6. Péptido recombinante homólogo al péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Polinucleótido aislado, que se traduce a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y se selecciona de la lista que comprende:
para su uso en la producción del péptido recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Polinucleótido según la reivindicación 7, donde la secuencia aminoacídica a la que se traduce presenta una identidad de, al menos un 70% con la SEQ ID NO: 1.
9. Polinucleótido según la reivindicación 7, donde la secuencia aminoacídica a la que se traduce presenta una identidad de, al menos un 80% con la SEQ ID NO: 1.
10. Polinucleótido según la reivindicación 7, donde la secuencia aminoacídica a la que se traduce presenta una identidad de, al menos un 90% con la SEQ ID NO: 1.
11. Polinucleótido según la reivindicación 7, donde la secuencia aminoacídica a la que se traduce presenta una identidad de, al menos un 95% con la SEQ ID NO: 1.
12. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 7-11, que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
13. Uso del péptido recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o un fragmento o derivado del mismo, como transposasa.
14. Uso del péptido recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, como herramienta útil para la transposición in vitro, o para la transgénesis y mutagénesis de forma aleatoria, tanto in vitro como in vivo.
15. Uso del péptido recombinante según la reivindicación 14, para la generación de mutaciones aleatorias in vitro.
16. Uso del péptido recombinante según la reivindicación 14, para la generación de transgénesis y mutagénesis aleatoria in vitro, en el genoma de células procariotas o eucariotas.
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