Adenovirus recombinante de replicación defectuosa basado en Ad5,

caracterizado porque dicho adenovirus recombinante de replicación defectuosa comprende una proteína hexón quimérica en la que se han sustituido las siete regiones hipervariables HVR1-7 de Ad5 tal como se definen en SEQ ID NO: 17-23 por las sietes secuencias de regiones hipervariables HVR1 a HVR7 de Ad48 tal como se definen por SEQ ID. NO: 24-30, o de Pan9 tal como se definen por SEQ ID NO: 52-58, y en el que las secuencias de la proteína hexón entre las secuencias de HVR proceden de Ad5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de la medicina, más en particular al campo del tratamiento terapéutico y profiláctico, usando vectores adenovirales quiméricos recombinantes que comprenden un ácido nucleico terapéutico en composiciones de vacuna.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se aplican ampliamente vectores adenovirales recombinantes para aplicaciones de terapia génica y vacunas. Hasta la fecha, se han identificado 51 serotipos de adenovirus diferentes. Se han estudiado de la forma más extensa los adenovirus del subgrupo C para aplicaciones tales como terapia génica; especialmente se usan ampliamente el serotipo 2 y 5 (Ad2 y Ad5) en la técnica. Se usa Ad5 recombinante en una variedad de fines diferentes, incluyendo vacunación. De manera importante, se ha mostrado que las vacunas a base del vector Ad5 provocan respuestas inmunitarias protectoras y potentes en una variedad de modelos animales. Además, están en marcha ensayos clínicos a gran escala para vacunación contra VIH en los que están usándose vectores recombinantes basados en Ad5 (documento WO 01/02607; documento WO 02/22080; Shiver et al. 2002; Letvin et al. 2002; Shiver y Emini. 2004). Sin embargo, la utilidad de las vacunas basadas en el vector Ad5 recombinante para VIH y otros patógenos probablemente estará significativamente limitada por la alta seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes (Acn) específicos de Ad5 en poblaciones humanas. Se ha mostrado que la existencia de inmunidad anti-Ad5 suprime sustancialmente la inmunogenicidad de vacunas basadas en Ad5 en estudios en ratones y monos rhesus. Datos tempranos de ensayos clínicos en fase 1 muestran que este problema también puede producirse en seres humanos (Shiver 2004).

Una estrategia prometedora para burlar la existencia de una inmunidad preexistente en individuos previamente infectados con los adenovirus humanos más comunes (tales como Ad5) implica el desarrollo de vectores recombinantes a partir de serotipos de adenovirus que no encuentran tales inmunidades preexistentes. Los vectores adenovirales humanos que se identificó que eran particularmente útiles se basan en los serotipos 11, 26, 34, 35, 48, 49 y 50 tal como se mostró en los documentos WO 00/70071, WO 02/40665 y WO 2004/037294 (véase también Vogels et al. 2003). Otros han encontrado que también el adenovirus 24 (Ad24) es de particular interés ya que se muestra que es un serotipo raro (documento WO 2004/083418).

Una estrategia similar se basa en el uso de adenovirus de simio ya que estos normalmente no infectan a seres humanos. Muestran una baja seroprevalencia en muestras humanas. Sin embargo, pueden aplicarse para uso humano ya que se mostró que estos virus podían infectar células humanas in vitro (documento WO 03/000283; documento WO 2004/037189).

Se mostró que las vacunas basadas en el vector de serotipo de adenovirus 35 (Ad35) podían provocar respuestas inmunitarias celulares potentes que no se suprimían significativamente por una inmunidad anti-Ad5 (Barouch et al. 2004; Vogels et al. 2003). De manera similar, se ha mostrado que los adenovirus de chimpancé provocan respuestas inmunitarias que se vieron mínimamente afectadas por una inmunidad anti-Ad5 (Farina et al. 2001; Pinto et al. 2003). Recientemente, se ha demostrado que las respuestas de linfocitos T CD8+ y anticuerpos neutralizantes (Acn) contribuyen ambos a la inmunidad anti-Ad5, mientras que los Acn específicos de Ad5 parecen desempeñar un papel primario (Sumida et al. 2004). Aunque este desarrollo parece ser un enfoque muy útil, también se ha demostrado en ratones que las vacunas basadas en el vector de Ad35 probaron ser menos inmunogénicas que las vacunas basadas en el vector de Ad5 en estudios en los que no había inmunidad frente a Ad5 preexistente (Barouch et al. 2004).

Evidentemente, existe una necesidad en el campo de vectores adenovirales alternativos que no encuentren inmunidades preexistentes en el huésped, pero que todavía sean inmunogénicos y capaces de inducir respuestas inmunes fuertes contra las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos heterólogos insertados en el ácido nucleico portado por el vector.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra la inmunogenicidad de vectores Ad5-Gag, Ad5HVR48(1)-Gag y Ad5HVR48(1-7) en ratones sin tratamiento previo que reciben (A) 109 pv, (B) 108 pv o (C) 107 pv. Se evaluaron las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de Gag mediante ensayos de unión a tetrámero Db/AL11 a múltiples puntos de tiempo tras la inmunización.

La figura 2 muestra la inmunogenicidad de vectores Ad5-Gag, Ad5HVR48(1)-Gag y Ad5HVR48(1-7) en ratones que reciben (A) 109 pv, (B) 108 pv o (C) 107 pv, preinmunizados con dos inyecciones de 1010 pv de Ad5Vacío entre 8 y 4 semanas antes de la inmunización.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:12) de la proteína hexón basada en Ad5, con la incorporación de las siete HVR para las siete HVR correspondientes (subrayadas) de Ad48 (Ad5HVR48(1-7)).

La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:16) de la proteína hexón basada en Ad5, con la incorporación de las siete HVR para las siete HVR correspondientes (subrayadas) del adenovirus Pan9 (Ad5HVRPan9(1-7)).

La figura 5 es un gráfico que indica la respuesta de linfocitos T CD8+ en ratones tras una preinmunización doble con Ad5-vacío, seguido por una sensibilización en el día 0 con Ad35-Gag y un refuerzo en el día 28 con tres vectores diferentes tal como se indica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En este documento se dan a conocer vectores adenovirales recombinantes recién desarrollados para una administración génica, vacunación y terapia génica mejoradas.

El virus producido según la invención es un adenovirus recombinante basado en un adenovirus del subgrupo C, Ad5, que se hace que sea de replicación defectuosa mediante una deleción funcional de la región E1 y en el que la proteína hexón en la cápsida viral es una proteína quimérica tal que se han sustituido las regiones hipervariables (HVR) por las HVR derivadas de un serotipo de adenovirus raro. Tales serotipos raros no encuentran Acn en la mayoría de los individuos en la población humana. Un serotipo preferido que se usa para proporcionar las HVR es Ad48. Preferiblemente, el virus recombinante comprende un ácido nucleico heterólogo de interés que va a administrarse al huésped para fines profilácticos o terapéuticos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Tal como se comentó anteriormente, el uso de vectores recombinantes basados en Ad5 se ha visto dificultado por la existencia de anticuerpos neutralizantes (Acn) que están presentes en la mayoría de los individuos humanos debido a una infección anterior con un virus de tipo natural. Aunque las diferentes proteínas de la cápsida presentes en la envuelta viral inducen anticuerpos en el huésped, se ha demostrado que la diana primaria de Acn específicos de Ad5 es la proteína hexón de Ad5 (Sumida et al. 2005). Esto condujo a la idea de que, cambiando la proteína hexón de manera que ya no pueda ser detectada por los Acn preexistentes, podrían producirse vectores adenovirales mejorados que serían beneficiosos en seres humanos que o bien todavía tienen Acn contra Ad5, o que se inmunizaron anteriormente con vacunas previas basadas en Ad5, o bien que se inmunizaron con vectores basados en Ad5 en un régimen de vacunación de sensibilización/refuerzo. Sin embargo, alterar la proteína hexón no resultó ser una tarea fácil. Generalmente, sólo han sido posibles cambios de hexones completos entre adenovirus dentro del mismo subgrupo de Ad o daban como resultado un virus escasamente viable (Youil et al. 2002; Gall et al. 1998; Roy et al. 1998). Si esta fuera la limitación, entonces un vector basado en Ad5 tenía que contener una proteína hexón de otros adenovirus del subgrupo C. Sin embargo, la mayoría de estos, si no todos, son inútiles en el sentido de que esos serotipos no se consideran raros. La mayoría de los individuos en la población humana se ha encontrado una vez con los serotipos del subgrupo C. Sería preferible usar un hexón de un serotipo que no deba encontrar Acn ya presentes. Esos serotipos raros se encuentran predominantemente en el subgrupo B (Ad11, Ad34, Ad35, Ad50) y D (Ad24, Ad26, Ad48 y Ad49).

Los inventores de la presente invención han mostrado por primera vez que (re)definiendo partes específicas del hexón y usando un enfoque conservador y datos de estructura y secuencia... [Seguir leyendo]

1. Adenovirus recombinante de replicación defectuosa basado en Ad5, caracterizado porque dicho adenovirus recombinante de replicación defectuosa comprende una proteína hexón quimérica en la que se han sustituido las siete regiones hipervariables HVR1-7 de Ad5 tal como se definen en SEQ ID NO: 17-23 por las sietes secuencias de regiones hipervariables HVR1 a HVR7 de Ad48 tal como se definen por SEQ ID. NO: 24-30, o de Pan9 tal como se definen por SEQ ID NO: 52-58, y en el que las secuencias de la proteína hexón entre las secuencias de HVR proceden de Ad5.

2. Adenovirus recombinante de replicación defectuosa según la reivindicación 1, que es un adenovirus basado

en Ad5 en el que se han sustituido las HVR1-7 de Ad5 tal como se definen por SEQ ID NO: 17-23 por las 10 HVR1-7 correspondientes de Ad48 tal como se definen por SEQ ID NO: 24-30.

3. Adenovirus recombinante de replicación defectuosa según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de hexón quimérica de SEQ ID NO: 12 o de SEQ ID NO 16:

4. Adenovirus recombinante de replicación defectuosa según la reivindicación 3, que comprende la secuencia de hexón quimérica de SEQ ID NO: 12.

15 5. Adenovirus recombinante de replicación defectuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un ácido nucleico heterólogo de interés que va a suministrarse al huésped para fines profilácticos o terapéuticos.