VACUNA RECOMBINANTE DE LEUCOTOXINA DE FUSOBACTERIUM NECROPHORUM Y LA PREPARACIÓN DE LA MISMA.

Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.

2 -6, en donde dicho polipéptido es capaz de inducir anticuerpos antileucotoxina en un mamífero, cuando se administra a dicho mamífero

LISTADO DE SECUENCIAS

Un Listado impreso de Secuencias acompaña esta solicitud, y también se ha presentado con contenidos idénticos en la forma de un archivo ASCII que puede ser leído por un ordenador sobre un disquete y un CD-ROM. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención

La presente invención se relaciona con métodos para clonación y expresión del gen de la leucotoxina de Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum), la secuenciación y caracterización de la proteína leucotoxina expresada por este gen, el truncamiento del gen en una serie de secuencias de nucleótidos, la amplificación de estas secuencias, la expresión y recuperación de los polipéptidos codificados por las secuencias de nucleótidos, y al utilización de la proteína y los polipéptidos en vacunas recombinantes con el propósito de conferir inmunidad efectiva contra una infección causada por la producción de leucotoxina por el F. necrophorum. Más particularmente, está relacionada con la producción de una vacuna de leucotoxina recombinante inactivada generada por la amplificación de cinco fragmentos del gen de la leucotoxina y una región secuencia arriba a través de PCR, digiriendo las secuencias de nucleótidos codificadas por los fragmentos con enzimas de restricción, expresando las secuencias de polipéptidos codificadas por las secuencias de nucleótidos a través de un vector de expresión, recuperando estas proteínas como cinco proteínas truncadas de leucotoxina (o polipéptidos), purificando estas proteínas (o polipéptidos) hasta homogeneidad aparente, con o sin inactivación de las proteínas truncadas y de longitud competa, y combinando las leucotoxinas recombinantes inactivadas con adyuvantes. Descripción del Estado del Arte

Los abscesos hepáticos en lotes de ganado de engorde son un serio problema económico, que provoca la confiscación de más de 3 millones de hígados y una pérdida estimada de $15 millones anuales en los Estados Unidos. Esta estimación se basa fundamentalmente en la confiscación de hígado y otros órganos, y no incluye las pérdidas económicas derivadas de un consumo reducido de alimento, una menor eficiencia en la alimentación, un menor porcentaje de rendimiento en canal y una menor ganancia de peso. Una gran cantidad de estudios han confirmado que el ganado con hígados con abscesos ganan menos (4 -5% en promedio) y tienen una menor eficiencia en la alimentación (7% en promedio) comparado con el ganado que tiene hígados sanos. La incidencia promedio de hígados con abscesos en el ganado alimentado con grano se aproxima al 25 -30%. En menor medida, los abscesos en el hígado en ovejas y en cabras son también un problema económico.

El F. necrophorum es un organismo gram negativo, con forma de bastoncillo, no formador de esporas, no móvil, anaerobio estricto y pleomórfico. Morfológicamente, el organismo varía desde bastoncillos cortos hasta filamentosos con extremos puntiagudos y redondeados. La longitud de las células varía desde cuerpos con forma de cocos de 0,5 -0,7 µm de diámetro hasta filamentos de más de 100 µm. Las colonias superficiales tienen 1 -2 mm de diámetro, son circulares, desde transparentes hasta opacas, y algunas cepas producen hemólisis α o β. El organismo fermenta glucosa, fructosa y maltosa solo débilmente con un pH final alrededor de 5.0 -6.3. Fermenta lactato hasta acetato, propionato, y butirato. El butirato es el principal producto de la fermentación de lactato. El indol se produce a partir de peptona. El F. necrophorum ha sido aislado a partir de la flora normal en la

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cavidad oral, de la cavidad gastrointestinal, y del tracto genitourinario de humanos y de animales. También se sabe que el organismo sobrevive en el suelo.

El F. necrophorum es un habitante normal del tracto gastrointestinal de animales y de humanos. Los factores de virulencia y los mecanismos patogénicos que contribuyen a la transición de este organismo de otro modo comensal a un patógeno no se conocen bien. Una leucotoxina, endotoxina, hemolisina, hemaglutinina, y diferentes enzimas tales como la desoxirribonucleasa y las proteasas han sido sugeridos como posibles factores de virulencia. Sin embargo, varios estudios implican a la leucotoxina, una proteína citotóxica para células polimorfonucleares de rumiantes, como el principal factor de virulencia. La importancia de la leucotoxina como un factor de virulencia en infecciones con F. necrophorum está indicada por medio de una correlación entre la producción de la toxina y la habilidad para inducir abscesos en animales de laboratorio, una inhabilidad de las cepas que no producen leucotoxina para inducir abscesos en las patas en el ganado después de inoculación intradérmica, y una relación entre títulos de anticuerpo antileucotoxina y de protección contra la infección en estudios experimentales de desafío.

El F. necrophorum es un patógeno oportunista que es el agente etiológico primario de abscesos hepáticos en animales rumiantes. [(Scanlan, y colaboradores, (1983); Bovine rumenitis-liver abscess complex: a bacteriological review. Cornell Vet. 73: 288 -297; Nagaraja, T. G. y colaboradores, (1998); Liver abscesses in feedlot cattle: A review. J. Anim. Sci., 76: 287 -298; y Tan, y colaboradores, (1996); Fusobacterium necrophorum infections: virulence factors, pathogenic mechanism and control measures. Vet. Res. Comm., 20: 113 -140)]. El organismo ha sido reconocido como un patógeno en animales y humanos desde finales de 1800, y se asocia a un agente etiológico primario o secundario con numerosas condiciones de enfermedad necrótica en animales domésticos y salvajes. Además de los abscesos hepáticos, el organismo es también el agente etiológico primario de la necrosis de las patas, abscesos en las patas, difteria en los terneros, y es frecuentemente aislado de los casos de mastitis, metritis, y lesiones necróticas de la cavidad oral.

Los abscesos hepáticos en el ganado son parte de una enfermedad compleja donde la formación de abscesos es secundaria a los focos primarios de infección en el epitelio del rumen. La patogénesis se puede resumir de la siguiente manera: (1) las lesiones ruminales son inducidas por acidosis como consecuencia de un cambio repentino en la dieta, de alta en fibra a alta en granos, una alimentación prolongada con una dieta alta en granos, u ocasionalmente por la penetración de un cuerpo extraño en el epitelio del rumen; (2) bacterias presentes en el rumen invaden el epitelio y forman abscesos focal en la pared del rumen; y (3) entrada de bacterias en la circulación portal, y son llevadas al hígado donde se localizan en el parénquima con la consecuente formación de abscesos.

La habilidad del F. necrophorum para establecerse en el hígado es atribuida a la producción de una toxina que es una proteína secretada de alto peso molecular activa contra leucocitos de los rumiantes llamadas leucotoxina (o leucocidina). La toxina es una proteína extracelular soluble que es citotóxica para neutrófilos, macrófagos, hepatocitos, y células ruminales. La leucotoxina protege contra fagocitosis y se cree que ayuda en el establecimiento del F. necrophorum en el hígado alterando directamente el mecanismo normal de defensa e indirectamente por el daño provocado por productos citolíticos liberados por los neutrófilos y macrófagos a las células hepáticas. Por lo tanto, la leucotoxina elaborada por el F. necrophorum juega un papel crítico en la infección del hígado por parte del F. necrophorum y se cree que es el factor primario de virulencia en la patogénesis de los abscesos hepáticos (Tan y colaboradores, 1996).

Se han descrito cuatro biotipos (A, B, AB y C) de F. necrophorum. (Langworth, (1977); Fusobacterium necrophorum: its characteristics and role as an animal pathogen. Bacteriol. Rev. 41:

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373 -390). El biotipo A, más frecuente aislado de abscesos de hígado, es más patógeno que el biotipo B, que predomina en abscesos de la pared ruminal. Los biotipos AB y C son raramente aislados en los abscesos del hígado (Berg, y colaboradores, (1982); Studies of Fusobacterium necrophorum from bovine hepatic abscesses: Biotypes, quantitation, virulence, and antibiotic susceptibility. Am. J. Vet. Res. 43: 1580 -1586), y el biotipo A tiene una patogenicidad intermedia que la de los biotipos A y B mientras que el biotipo C no es patógeno. (Shinjo, y colaboradores, (1990); Recognition of biovar C of Fusobacterium necrophorum (flugge) Moore and Holdeman as Fusobacterium pseudonecrophorum sp. nov., nom. rev. (ex prevot 1940) Int. J. Sys. Bacteriol. 41: 395 -397). Los biotipos A y B, los tipos más frecuentemente...

1. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6, en donde dicho polipéptido es capaz de inducir anticuerpos antileucotoxina en un mamífero, cuando se administra a dicho mamífero.

2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 60% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

3. El polipéptido aislado de la reivindicación 1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 75% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

4. El polipéptido aislado de la reivindicación 1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 87% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

5. El polipéptido aislado de la reivindicación 1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 95% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

6. Un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13, en donde dichas secuencias de nucleótidos codifican secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6, y en donde dicho polipéptido es capaz de inducir anticuerpos antileucotoxina en un mamífero, cuando se administra a dicho mamífero.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 6 que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 60% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 6 que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 75% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 6 que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 87% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

10. El ácido nucleico de la reivindicación 6 que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 95% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

11. Un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6 y en donde dicho polipéptido es capaz de inducir anticuerpos antileucotoxina en un mamífero, cuando se administra a dicho mamífero.

12. El vector e la reivindicación 11, teniendo dicha secuencia de nucleótidos aproximadamente al menos 60% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

13. El vector e la reivindicación 11, teniendo dicha secuencia de nucleótidos aproximadamente al menos 75% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

14. El vector e la reivindicación 11, teniendo dicha secuencia de nucleótidos aproximadamente al menos 87% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

15. El vector e la reivindicación 11, teniendo dicha secuencia de nucleótidos aproximadamente al menos 95% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

16. Una vacuna que comprende un polipéptido que tiene una secuencia que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

17. La vacuna de la reivindicación 16, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 60% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

18. La vacuna de la reivindicación 16, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 75% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

19. La vacuna de la reivindicación 16, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 87% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

20. La vacuna de la reivindicación 16, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 95% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

21. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, comprendiendo además dicha vacuna un portador farmacológicamente compatible.

22. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, comprendiendo además dicha vacuna un adyuvante.

23. Un polipéptido recombinantemente derivado que tiene una secuencia que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 1 -6, en donde dicho polipéptido es capaz de inducir anticuerpos antileucotoxina en un mamífero, cuando se administra a dicho mamífero.

24. El polipéptido de la reivindicación 23, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 60% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

25. El polipéptido de la reivindicación 23, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 75% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

26. El polipéptido de la reivindicación 23, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 87% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

27. El polipéptido de la reivindicación 23, teniendo dicha secuencia aproximadamente al menos 95% de homología de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

28. Un método de preparación de una vacuna que confiere inmunidad efectiva contra una

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infección causada por F. necrophorum que comprende las etapas de: a) proveer el gen de F. necrophorum que expresa leucotoxina; b) truncamiento de dicho gen de F. necrophorum en una pluralidad de secuencias de

nucleótidos discretos, cada una de dichas secuencias de nucleótidos discretos que codifica un polipéptido respectivo que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 1 -6;

c) expresión y recuperación de dicho polipéptido respectivo; d) combinación de dicho polipéptido recuperado con un portador compatible farmacológicamente adecuado para producir dicha vacuna.

29. El método de la reivindicación 28, comprendiendo dicho gen la SEQ ID No. 8.

30. El método de la reivindicación 28 ó 29, teniendo dichas secuencias de nucleótidos discretos una secuencia que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 9 -13.

31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, que comprende además la etapa de combinar dichos polipéptidos recuperados con un adyuvante adecuado.

32. El método de la reivindicación 28, que comprende además la etapa de amplificar al menos una de dichas secuencias de nucleótidos discretos a través de PCR.

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, siendo dicho vacuna capaz de provocar la respuesta de un anticuerpo en un organismo seleccionado del grupo que consiste de ganado, ovejas, y cabras.

34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, siendo dicho vacuna sustancialmente no tóxica.

35. El uso de un polipéptido aislado que tiene aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 1 -6 para la preparación de una vacuna recombinante que induce la producción de anticuerpo antileucotoxina para inmunizar un animal contra abscesos hepáticos causados por F. necrophorum.

36. Un polipéptido recombinante aislado que es reconocidos por anticuerpos antileucotoxina nativa en un análisis de transferencias tipo Western, teniendo dicho polipéptido aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6.

37. Un secuencia de un polipéptido recombinante aislado cuya actividad neutralizadora de los antisueros de una leucotoxina nativa contra leucocitos polinucleares de bovino, teniendo dicho polipéptido aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 1, 2 y 4.

38. Un polipéptido aislado derivado en forma recombinante efectivo para conferir inmunidad protectora contra una infección por F. necrophorum en animales, teniendo dicho polipéptido aproximadamente al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada de las SEQ ID Nos. 2 y 5.

39. El uso de un polipéptido aislado que contiene una secuencia que tiene al menos 50% de homología de secuencia sobre toda la longitud con una secuencia seleccionada del grupo que

76 consiste de las SEQ ID Nos. 2 -6 para la preparación de una vacuna para prevenir la necrosis de las patas causada por una infección con F. necrophorum.

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