La presente invención se refiere a la utilización del gen que codifica la fosfopanteteina adenil transferasa (PPAT) como regulador de la biosíntesis de CoA para la generación de nuevas variedades vegetales que presentan crecimiento mejorado,

resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido en lípidos en sus semillas y composición aminoacídica alterada. Concretamente la invención se refiere a la utilización de este gen como regulador de la biosíntesis de CoA en plantas para modificar el fenotipo de la planta, así como a las plantas obtenidas genéticamente modificadas, cuyo crecimiento, resistencia a estrés osmótico y salino y contenido en lípidos de sus semillas es mayor que en las plantas sin modificar, y que presentan su composición aminoacídica alterada

Utilización del enzima fosfopanteteina adeniltransferasa, implicado en la biosíntesis del coenzima A, en la mejora del crecimiento vegetal, resistencia al estrés salino/osmótico, incremento de lípidos de reserva y modificación del contenido aminoacídico.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a la utilización del gen que codifica la fosfopanteteina adeniltransferasa (PPAT) como regulador de la biosíntesis de CoA para la generación de nuevas variedades vegetales que presentan crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico y salino, aumento de contenido en lípidos en sus semillas y composición aminoacídica alterada. Concretamente, la invención se refiere tanto a la utilización de este gen como regulador de la biosíntesis de CoA como a las plantas obtenidas, genéticamente modificadas que presentan su fenotipo modificado, cuyo crecimiento, resistencia a estrés osmótico y salino y contenido en lípidos de sus semillas es mayor que en las plantas sin modificar, y que presentan su composición aminoacídica alterada.

Antecedentes de la invención

La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en numerosas rutas biosintéticas, degradativas y metabólicas productoras de energía (Begley et al., 2001). La síntesis de CoA, partiendo de pantotenato como precursor, se produce en cinco etapas y se han clonado las correspondientes enzimas biosintéticas tanto en procariotas como en eucariotas superiores (Begley et al., 2001; Daugherty et al., 2002; Kupke et al., 2003; Leonardi et al., 2005). La ruta universal para la biosíntesis de CoA a partir de pantotenato está iniciada por la fosforilación de este precursor para generar 4'-fosfopantotenato, que está catalizada por la pantotenato kinasa (PK, CoaA). En organismos unicelulares y sistemas animales, la velocidad de biosíntesis de CoA parece estar regulada mediante inhibición por retroalimentación de PK. Recientemente, se han caracterizado dos PK de plantas, concretamente AtPANK1 y AtPANK2 en Arabidopsis y, como resultado, se encontró que un doble mutante pank1-1pank2-1 era letal para los embriones (Tilton et al, 2006). La segunda etapa de la biosíntesis de CoA supone la adición de cisteina a 4'-fosfopantotenato mediada por 4'-fosfo-N-pantotenoilcisteín sintetasa (PPCS, CoaB). En la siguiente etapa, la 4'-fosfo-N-pantotenoilcisteín descarboxilasa (PPCDC, CoaC) cataliza la generación de 4'-fosfopanteteina. Dos genes de Arabidopsis, AtHAL3A y AtHAL3B, codifican para enzimas PPCDC esenciales, y una inactivación combinada de ambos genes abortó la embriogénesis en la fase globular temprana (Rubio et al., 2006). La penúltima etapa en la ruta biosintética de CoA está catalizada por la enzima 4'-fosfopanteteina adeniltransferasa (PPAT, CoaD), que cataliza la adenilación reversible de 4'-fosfopanteteina para formar 3'-desfosfo-CoA (dPCoA) y pirofosfato (PPi) (véase más adelante la figura 5a). Finalmente, la desfosfo-CoA kinasa (DPCK, CoaE) cataliza la última etapa de la ruta biosintética de CoA, que supone la fosforilación del grupo 3'-hidroxilo del resto del azúcar ribosa de dPCoA para formar CoA y ADP.

Considerando el papel fundamental de CoA en el metabolismo de las plantas, el análisis de mutantes con alteración en la biosíntesis de CoA ha recibido una atención limitada (Rubio et al., 2006; Tilton et al., 2006). Recientemente, hemos notificado que un doble mutante HAL3A-1 HAL3B-1 era letal para los embriones, mientras que las plántulas que eran nulas para HAL3A y heterocigóticas para HAL3B (mutante aaBb hal3), presentaron un fenotipo dependiente de sacarosa (Sac) para el establecimiento de las plántulas (Rubio et al., 2006).

La presente solicitud de patente, se centra en la siguiente etapa de la biosíntesis de CoA, que está catalizada por la enzima PPAT. Los estudios en sistemas modelo de los productos intermedios en la biosíntesis de CoA han mostrado que, además del control de la síntesis al nivel de PK, la modulación adicional del flujo a través de la ruta se produce en PPAT, ya que tanto pantotenato como 4'-fosfopanteteina pueden acumularse en la célula en condiciones limitantes para la biosíntesis de CoA (Jackowski y Rock, 1984; Rock et al., 2000). En seres humanos, ambas actividades PPAT y DPCK están codificadas en un único gen que da lugar a una enzima bifuncional denominada CoA sintasa (Daugherty et al., 2002). Por el contrario, las plantas tienen diferentes enzimas monofuncionales codificadas por genes distintos (Kupke et al., 2003).

Así, se ha identificado el producto génico PPAT de Arabidopsis por su fuerte homología con el equivalente en seres humanos en CoA sintasa, y se ha confirmado su actividad bioquímica in vitro (Kupke et al., 2003).

Esta solicitud de patente presenta el análisis de mutantes de ganancia de función y reducción de función en PPAT, proporcionando una evidencia de su función sobre el crecimiento de las plantas, la resistencia al estrés osmótico y el metabolismo de los lípidos, llegando a la conclusión de que las plantas que sobreexpresan PPAT, presentan crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico, aumento de contenido en lípidos en sus semilla y composición aminoacídica modificada.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención se refiere a la utilización del gen que codifica la fosfopanteteina adeniltransferasa (PPAT) de Arabidopsis thaliana (SEQ. ID. NO:2) (Gen At2g18250) como regulador de la biosíntesis de CoA plantas para modificar el fenotipo de la planta de manera que la planta resultante presente crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico, aumento de contenido en lípidos en sus semillas y composición aminoacídica alterada.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso del gen que codifica la PPAT en especies de interés agronómico e industrial como regulador de la biosíntesis de CoA en plantas. Este uso conlleva la sobreexpresión de PPAT conduciendo a la generación de plantas que presentan crecimiento y resistencia al estrés osmótico mejorados así como mayor contenido en lípidos de sus semillas y composición aminoacídica alterada en comparación con plantas de tipo silvestre.

Como regulador se entiende el gen, y por tanto la proteína (enzima) por él codificada que regula la ruta de biosíntesis (o parte de la ruta que subyace) de CoA, cuya función está relacionada con el crecimiento de las plantas, su resistencia al estrés osmótico, el contenido en lípidos de sus semillas y el metabolismo de aminoácidos.

Como gen que codifica la PPAT en especies de interés agronómico e industrial se entiende tanto el gen PPAT como secuencias homólogas de genes PPAT de otros organismos y con función equivalente a la PPAT de Arabidopsis.

Entre estas especies de interés agronómico e industrial se incluyen, aunque no de forma exclusiva: arroz, colza, col, chopo, vid, tomate, patata, leguminosas, maíz, soja, algodón, etc. Puesto que el gen que codifica la enzima PPAT está conservado desde musgo hasta especies arbóreas (pícea, chopo) y desempeña una función imprescindible en la célula vegetal, es razonable suponer que está conservado en todas las especies vegetales. De hecho se muestra en los alineamientos de la exposición detallada de un modo de realización que el producto génico PPAT está presente en aquellos genomas vegetales disponibles en bases de datos públicas.

En la descripción de la invención, se realizan estudios sobre la implicación del gen PPAT en el aumento o disminución del crecimiento de las plantas, su resistencia al estrés osmótico, el contenido en lípidos de sus semillas y la alteración de su composición aminoacídica. Los experimentos se realizan con la línea mutante ppat-1 que muestra una reducción de un 90% en la expresión de PPAT, generada por inserción de ADN-T en el gen PPAT (SEQ. ID. NO: 2) de Arabidopsis, así como con la línea de sobreexpresión de PPAT OE, generada por transformación de plantas de tipo silvestre con una copia adicional del gen que codifica la PPAT.

Otro objeto de la presente invención se refiere a las plantas obtenidas, genéticamente modificadas, cuyo crecimiento, resistencia a estrés osmótico y salino y contenido en lípidos de sus semillas es mayor que en las plantas sin modificar, y que presentan su composición aminoacídica modificada.

Otro objeto de la invención se refiere a las semillas producidas...

1. Uso del gen que codifica la enzima PPAT en especies vegetales como regulador de la síntesis de CoA.

2. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicación 1, donde dicho gen es homólogo al gen PPAT de A. Thaliana.

3. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque dicha regulación se produce por ganancia de función del gen que codifica la PPAT.

4. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha ganancia de función es por sobreexpresión de PPAT.

5. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sobreexpresión es producida por inserción de una copia adicional del gen PPAT en el genoma de la planta.

6. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicación 5, caracterizado porque la copia adicional del gen PPAT es insertada bajo el control de un promotor constitutivo.

7. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicación 6, caracterizado porque la copia adicional del gen PPAT es insertada bajo el control del promotor constitutivo 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor en el genoma de la planta.

8. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque dicha regulación implica un aumento en los niveles de síntesis de CoA.

9. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque dicha regulación implica un aumento en los niveles de síntesis de CoA+ACoA de 1,6 veces superior a los niveles de CoA+ACoA en plantas silvestres.

10. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque dicha regulación implica un aumento en el crecimiento vegetativo y reproductivo de las plantas, aumento de la producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido en ácidos grasos en las semillas y composición aminoacídica modificada.

11. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicación 10 caracterizado porque dicha regulación implica una disminución de dos días en el tiempo de floración en comparación con plantas de tipo silvestre.

12. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 10 y 11 caracterizado porque dicha regulación implica mayor resistencia al estrés osmótico y salino debido a la acumulación de prolina.

13. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicación 12 caracterizado porque dicha regulación implica una acumulación de prolina dos veces mayor que los niveles de prolina en plantas silvestres.

14. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 10 a 13 caracterizado porque dicha regulación implica que el aumento del contenido en ácidos grasos se produzca en ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido eicosanoico.

15. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 10 a 14 caracterizado porque dicha regulación implica que el contenido en ácidos grasos en las semillas sea 35-50% superior que en las semillas de plantas silvestres.

16. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según las reivindicaciones 1 a 15, para la obtención de plantas transgénicas que presenten mayor crecimiento vegetativo y reproductivo, mayor producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido en ácidos grasos en las semillas y composición aminoacídica modificada.

17. Plantas modificadas genéticamente, según la reivindicación 16, caracterizada por su ganancia de función del gen PPAT para regular la síntesis de CoA.

18. Planta modificada genéticamente según reivindicación 17 caracterizada porque la ganancia de función del gen PPAT es producida por inserción de una copia adicional del gen PPAT.

19. Planta modificada genéticamente según reivindicaciones 17 y 18 caracterizada porque la inserción de la copia adicional del gen PPAT se produce bajo el control de un promotor constitutivo.

20. Planta modificada genéticamente según reivindicaciones 17 a 19 caracterizada porque la inserción de la copia adicional del gen PPAT se produce bajo el control del promotor constitutivo 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.

21. Planta modificada genéticamente según reivindicaciones 17 a 20 caracterizada por presentar mayor crecimiento vegetativo y reproductivo, mayor producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino y mayor contenido en ácidos grasos en las semillas, que las plantas silvestres, así como composición aminoacídica modificada.

22. Semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente según reivindicaciones 17 a 21, caracterizadas por presentar mayor contenido en ácidos grasos en las semillas, que las semillas de plantas silvestres.

23. Semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente según reivindicaciones 17 a 22, caracterizadas porque el aumento del contenido en ácidos grasos se produce principalmente en ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido eicosanoico.

24. Semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente según reivindicaciones 17 a 23, caracterizadas porque el contenido en ácidos grasos en las semillas es 35-50% superior que en las semillas de plantas silvestres.

25. Uso de las semillas y/o plantas transgénicas según reivindicaciones 17 a 24 en la producción de aceites vegetales.

26. Uso de las plantas según reivindicación 25 en la producción de aceites vegetales.

27. Uso de las semillas según reivindicación 25 en la producción de aceites vegetales.

28. Uso de las semillas y plantas transgénicas según reivindicaciones 25 a 27 caracterizado porque dichos aceites son para uso en alimentación.

29. Uso de las semillas y/o plantas transgénicas según reivindicaciones 25 a 27 caracterizado porque dichos aceites son para uso en la industria del biodiesel.

30. Uso de las semillas y/o plantas transgénicas según reivindicaciones 17 a 24 en la industria de la alimentación animal.

31. Uso de las semillas transgénicas según reivindicación 30 en la industria de la alimentación animal.

32. Uso de las plantas transgénicas según reivindicación 30 en la industria de la alimentación animal.