USO DE UN FRAGMENTO DE ENDOPLASMINA Y DERIVADOS DEL MISMO COMO BIOMARCADOR PARA ADENOMA Y/O CARCINOMA COLORRECTAL; MÉTODO DE DETECCIÓN Y SISTEMA DE ENSAYO.

Un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal o un método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal o un método para monitorizar el desarrollo y/o la evolución y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende las etapas:

a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha extraído de un individuo, b) determinar el nivel de un fragmento de endoplasmina en dicho material de muestra aislado, c) comparar el nivel determinado de un fragmento de endoplasmina con uno o más valores de referencia, en el que el fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10 a 14 kDa

La presente invención se refiere al campo de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.

El carcinoma colorrectal es el tercer carcinoma diagnosticado con más frecuencia (9,4%) en todo el mundo. En 2003, se diagnosticaron casi 945.000 nuevos casos de carcinoma colorrectal en todo el mundo y aproximadamente

492.000 personas murieron de esta enfermedad. La incidencia del carcinoma colorrectal está aumentando, mientras que la tasa de mortalidad del carcinoma colorrectal está disminuyendo. La incidencia del carcinoma colorrectal aumenta con la edad, comenzando a aproximadamente los 40 años de edad, y es mayor para hombres que para mujeres (40,6 para hombres frente a 30,6 para mujeres, por 100.000 por año) (World cancer report, 2003, Ed. BW. Stewart and P. Kleihues. IARC Press, Lyon).

En la mayoría de los pacientes, el desarrollo del carcinoma colorrectal sigue una progresión de múltiples etapas desde adenoma premaligno a tumores invasivos que son propensos a la metástasis.

Hasta el momento, solamente desagradables ensayos de cribado colorrectal, tales como colonoscopia, han demostrado conseguir la detección de carcinoma colorrectal en fase temprana y sus precursores. Sin embargo, se han observado grandes tasas de falsos negativos para lesiones neoplásicas planas y lesiones polipoides menores de 10 mm de diámetro (Kudo S. (1997) Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 7: 87-98). Por lo tanto, sería deseable tener un sistema de ensayo que permita la detección temprana de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal, así como la discriminación específica entre diferentes fases tumorales. Esto también permitiría una adaptación específica de la terapia.

Los ensayos de cribado conocidos actualmente basados en la detección de un marcador tumoral en muestras de sangre carecen de la sensibilidad y la especificidad necesarias. Por ejemplo, los niveles de CEA (antígeno carcinoembrionario) en muestras de sangre se han usado para detectar carcinoma de colon. Sin embargo, los niveles de CEA no son específicamente elevados en carcinoma de colon y han demostrado ser elevados también en pacientes con otras enfermedades malignas (por ejemplo, cánceres de estómago, páncreas, mama y pulmón) y con diversas afecciones no malignas (por ejemplo, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad intestinal inflamatoria, fuerte consumo de cigarrillos, bronquitis crónica y pancreatitis). (Posner MR, Mayer RJ: The use of serologic tumor markers in gastro intestinal malignancies. Hematol Oncol Clin North Am 8: 533, 1994). Además, los niveles de CEA no son elevados en adenomas de colon. Además, los niveles de CEA no son adecuados para distinguir adenoma colorrectal de carcinoma colorrectal o diferentes fases tumorales.

El documento Wang Xiao-Ping et al., World J. Gastroenterol. 2005; 11(7): 1056-1059 se refiere a la correlación entre la patología clínica y la expresión de la proteína de choque térmico 70 y la proteína regulada por glucosa 94 en adenocarcinoma de colon humano.

La página Web http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP/mgi/92825.htlm describe que endoplasmina en un sinónimo de proteína regulada por glucosa de 94 kDa.

El documento DE 100 19 967 A1 describe anticuerpos contra gp96 nativa.

El documento Schreiter K. et al., Gut 2005; 54: 935-943 se refiere a la expresión de glucoproteína (gp) 96 inducida durante la diferenciación de macrófagos intestinales, pero alterada en la enfermedad de Crohn.

Un objeto de la invención es proporcionar medios que permitan una detección temprana de adenoma de colon y/o carcinoma de colon.

Es un objeto adicional proporcionar un biomarcador que pueda usarse en la detección de adenoma y/o carcinoma colorrectal.

Los objetos esenciales de la presente invención se resuelven mediante el uso de un fragmento de endoplasmina que tiene un peso molecular de 10-14 kDa como biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo. La detección se realiza in vitro.

Los objetos se resuelven además mediante un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende las etapas:

**(Ver fórmula)**

a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha extraído de un individuo,

b) determinar el nivel de un fragmento de endoplasmina en dicho material de muestra aislado,

c) comparar el nivel determinado de un fragmento de endoplasmina con uno o más valores de referencia,

en el que el fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10 a 14 kDa.

Los objetos se resuelven además mediante un método para discriminar adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal, que comprende las etapas:

a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha extraído de un individuo,

b) determinar el nivel de un fragmento de endoplasmina en dicho material de muestra aislado,

c) comparar el nivel determinado de un fragmento de endoplasmina con uno o más valores de referencia.

en el que el fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10 a 14 kDa.

Los objetos también se resuelven mediante un método para monitorizar el desarrollo y/o la evolución y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal, que comprende las etapas:

a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha extraído de un individuo,

b) determinar el nivel de un fragmento de endoplasmina en dicho material de muestra aislado,

c) comparar el nivel determinado de un fragmento de endoplasmina con uno o más valores de referencia,

en el que el fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10 a 14 kDa.

En una realización preferida, la eficacia de un procedimiento quirúrgico o terapéutico está controlada para decidir si el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal está completamente extirpado. En otra realización, la terapia de un paciente con adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal tratando al paciente con una o más sustancias químicas, anticuerpos, proteínas, péptidos, fármaco de molécula pequeña, ARN antisentido, radiación, por ejemplo rayos X, o combinaciones de los mismos está controlada para controlar la eficacia del tratamiento.

Los métodos de la invención pueden usarse con un método de ensayo para detectar adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal en una muestra de un individuo, que comprende:

a) un anticuerpo o un receptor que se une a un epítopo de un fragmento de endoplasmina o un derivado del mismo,

b) un soporte sólido que soporta a dicho anticuerpo o receptor,

c) un reactivo para detectar la unión de dicho epítopo de un fragmento de endoplasmina o un derivado del mismo a dicho anticuerpo o receptor.

Los métodos de la invención pueden usarse con una matriz (array) que comprende moléculas de detección para la detección de adenoma colorrectal y/o cáncer por carcinoma colorrectal y/o en un individuo, que comprende como molécula de detección:

a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada en un soporte sólido para unirse a y detectar ARNm que codifica un fragmento de endoplasmina o un derivado del mismo, o

b) un anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido para la unión a y la detección de un epítopo de un fragmento de endoplasmina o un derivado del mismo, o

c) un receptor inmovilizado en un soporte sólido para la unión a y la detección de un epítopo de un fragmento de endoplasmina o un derivado del mismo,

en la que preferentemente diferentes cantidades de moléculas de detección están inmovilizadas en el soporte sólido para aumentar la precisión de la cuantificación.

**(Ver fórmula)**

La sonda de ácido nucleico se selecciona, por ejemplo, entre el grupo constituido por ADN o ARN de cadena sencilla

o de cadena doble, aptámeros y combinaciones de los mismos. Los aptámeros son oligonucleótidos de cadena sencilla que asumen una forma dependiente de la secuencia, específica y se unen a proteínas objetivo con alta especificidad y afinidad. Los aptámeros se identifican usando el proceso SELEX (Tuerk C. y Gold L. (1990) Science

249: 505-510; Ellington AD. y Szostak JW (1990) Nature 346, 818-822).

En las reivindicaciones dependientes se... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal o un método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal o un método para monitorizar el desarrollo y/o la evolución y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende las etapas:

a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha extraído de un individuo,

b) determinar el nivel de un fragmento de endoplasmina en dicho material de muestra aislado,

c) comparar el nivel determinado de un fragmento de endoplasmina con uno o más valores de referencia,

en el que el fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10 a 14 kDa.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10,3 kDa.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el fragmento de endoplasmina comprende la secuencia peptídica SEC ID Nº 2 y/o SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 4.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el nivel de un fragmento de endoplasmina en dicho material de muestra extraído de un paciente con adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal aumenta en comparación con un material de muestra de un individuo sano.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un primer aumento del nivel de un fragmento de endoplasmina en un primer material de muestra es indicativo de adenoma colorrectal y en el que un segundo aumento del nivel de un fragmento de endoplasmina en una segundo material de muestra, aislado de dicho individuo en un momento posterior respecto a dicho primer material de muestra, es indicativo de carcinoma colorrectal, con la condición de que dicho segundo aumento sea más fuerte que dicho primer aumento.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa (b) uno o más biomarcadores para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se determinan en dicho material de muestra aislado y en el que en la etapa (c) el nivel determinado de dichos biomarcadores se compara con uno o más valores de referencia respectivos.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dichos biomarcadores adicionales para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se seleccionan entre el grupo constituido por alfa-defensina 1, 2 ó 3, transtirretina, p53, C3a, CEA (antígeno carcinoembrionario), CA 19-9, CA 15-3, CA-125, Kras, -Catenina, Her2/neu, proteína C-reactiva e inestabilidad de microsatélite de MHL1 o MSH2 y combinaciones de los mismos.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los valores de referencia de un fragmento de endoplasmina y opcionalmente los valores de referencia de biomarcadores adicionales se calculan como el nivel promedio de un fragmento de endoplasmina y opcionalmente biomarcadores adicionales en una pluralidad de muestras aisladas de un grupo respectivo de individuos, en el que el grupo de individuos son individuos sanos, pacientes con adenoma colorrectal y/o pacientes con carcinoma colorrectal.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el valor de referencia es un valor de referencia individual calculado como el nivel promedio de un fragmento de endoplasmina y opcionalmente de biomarcadores adicionales determinado en una pluralidad de material de muestra aislado extraído de dicho individuo en un periodo de tiempo.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material de muestra aislado es un fluido corporal o tejido y en el que el fluido corporal se selecciona entre el grupo constituido por sangre, plasma sanguíneo, suero, médula ósea, heces, líquido sinovial, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo, esputo, orina, leche materna, esperma, exudado y mezclas de los mismos.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de un fragmento de endoplasmina y opcionalmente de biomarcadores adicionales en dicho material de muestra se determina a nivel proteico.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de un fragmento de endoplasmina y opcionalmente de biomarcadores adicionales en dicho material de muestra se determina mediante métodos inmunológicos o técnica proteómica y/o espectrometría de masas.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método se realiza en combinación con otros métodos de diagnóstico para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o la especificidad.

14. Un uso de un fragmento de endoplasmina como biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en una muestra aislada de un individuo, en el que dicho fragmento de endoplasmina tiene un peso molecular de 10 a 14 kDa.

**(Ver fórmula)**

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, para una detección temprana de adenoma colorrectal y/o 5 carcinoma colorrectal en una muestra aislada de un individuo.

16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, en combinación con uno o más biomarcadores adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad y/o la especificidad.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que al menos un biomarcador adicional se selecciona entre

10 el grupo constituido por alfa-defensina 1, 2 ó 3, transtirretina, p53, C3a, CEA (antígeno carcinoembrionario), CA 199, CA 15-3, CA-125, Kras, -Catenina, Her-2/neu, proteína C-reactiva e inestabilidad de microsatélite de MHL1 o MSH2 y combinaciones de los mismos.