USO DE NUEVOS BIOMARCADORES PARA LA DETECCIÓN DE CARCINOMA TESTICULAR IN SITU Y CÁNCERES DERIVADOS EN MUESTRAS HUMANAS.

Uso de nuevos biomarcadores para la detección de carcinoma testicular in situ y cánceres derivados en muestras humanas Campo de la invención La presente invención proporciona un biomarcador que caracteriza el carcinoma testicular in situ (CIS), que es el precursor de los seminomas y no seminomas testiculares clásicos. El mismo biomarcador se puede usar para caracterizar el gonadoblastoma, una lesión precancerosa de tipo CIS observada en gónadas disgenéticas. El biomarcador es AP 2. Antecedentes de la invención El carcinoma testicular in situ (CIS) es el precursor frecuente de casi todos los tumores de células germinales testiculares (TCGT) que se producen en adultos jóvenes. La incidencia de TCGT ha aumentado considerablemente durante las últimas décadas y, actualmente, estos tumores son el tipo más frecuente de cáncer en varones jóvenes. Las células de CIS pueden transformarse en un seminoma o en un no seminoma. El seminoma conserva un fenotipo de tipo célula germinal, mientras que el tumor conocido como no seminoma o teratoma conserva características de células madre embrionarias pluripotenciales y la capacidad para diferenciarse en prácticamente todos los tejidos somáticos. Los no seminomas comprenden carcinoma embrionario (CE), varias mezclas de componentes de tejido teratomatoso diferenciado y tejidos extraembrionarios, tales como los tumores del saco vitelino y el coriocarcinoma. Además del CIS, el gonadoblastoma, una lesión de tipo CIS, se produce en testículos disgenéticos y gónadas intersexuales, que con frecuencia puede contener algunas estructuras ováricas. La única diferencia entre el CIS y el gonadoblastoma se refiere a la arquitectura global de la lesión en la gónada adyacente (el CIS normalmente se encuentra en hileras sencillas a lo largo de la membrana basal y existe una capa sencilla de células de Sertolli entre las células de CIS y la luz de los túbulos seminíferos, mientras que el gonadoblastoma contiene nidos (acúmulos) de células de tipo CIS rodeados por pequeñas células somáticas de tipo granulosa y, en ocasiones, células de tipo espermatogonias). La morfología y los patrones de expresión génica de células CIS y las células de gonadoblastoma son indistinguibles (Jørgensen y col. Histopathology 1997), por tanto, además en esta solicitud, los presentes inventores usan el término CIS para ambas lesiones precursoras. El marcador más usado para CIS en la práctica clínica es la fosfatasa alcalina de tipo placentario (ALPP o PLAP) (Manivel, JC, y col. Am J Surg Pathol 1987, 11:21-9), que también es un marcador conocido de las células germinales primordiales. Las pruebas epidemiológicas y las pruebas basdas en estudios comparativos inmunohistoquímicos de proteínas expresadas en CIS y células germinales fetales indican que el CIS es una lesión congénita, que probablemente se produzca en los gonocitos en los primeros estadios de la vida fetal y progresen a un TCGT franco tras la pubertad. La naturaleza precisa de los acontecimientos moleculares subyacentes al inicio de la transformación maligna desde gonocito a una célula de CIS todavía no se ha dilucidado, y la posterior progresión a tumores francos sigue sin conocerse en gran parte. Looijenga y col. 2003, POU5F1 (OCT3/4) Identifies Cells with Pluripotent Potential in Human Germ Cell Tumors, Cancer Research 63, p. 2244-2255, divulga un estudio que atañe al uso de POU5F1 (OCT3/4) como marcador de tumores de células germinales humanos. El estudio analiza la presencia de POU5F1 en tumores de células germinales humanos y otros tipos de tumores usando inmunohistoquímica. El estudio verifica que la expresión de POUF1 es específica de subtipos concretos de tumores de células germinales humanos de adultos. Con el fin de identificar nuevos marcadores para la detección precoz de CIS, los presentes inventores analizaron la expresión génica en células y tumores de CIS de un modo sistemático, empleando una metodología de visualización diferencial (VD) y usando una micromatriz de ADNc que cubre todo el transcriptoma humano. Sumario de la invención ES 2 365 466 T3 En los estudios en micromatriz, los presentes inventores han salvado la detección de cambios en la expresión génica no relacionados con el CIS (ya que las células de CIS sólo constituyen un pequeño porcentaje de células en una muestra tisular típica) usando tejidos de testículos que contienen diferentes cantidades de túbulos con CIS y han buscado genes regulados de un modo proporcional al contenido de CIS en la muestra. Cantidades seleccionadas de marcadores de CIS y tumorales de la VD y el estudio en micromatriz se han verificado mediante PCR con transcriptasa inversa (RTPCR) semicuantitativa y el tipo de célula que lo expresa se determinaron mediante hibridación in situ. De forma adicional, los presentes inventores usan anticuerpos contra algunos candidatos prometedores y usaron inmunohistoquímica para identificar los tipos de célula que los expresan en tejidos con 2 CIS/gonadoblastoma y en tumores derivados de CIS. Los presentes inventores también han investigado el nivel génico de tránscritos (usando la misma micromatriz grande de ADNc) de seminoma testicular y carcinoma embrionario (CE, un componente indiferenciado de los no seminomas) y lo compararon con el nivel de tránscritos de CIS. Esto facilitó la identificación de los genes que marcan la progresión de CIS en el seminoma o el no seminoma. Los resultados se confirmaron mediante RT-PCR y los marcadores se localizaron en las células tumorales mediante hibridación in situ, así como para marcadores seleccionados al nivel proteico mediante inmunohistoquímica. El carcinoma in situ (CIS) es el precursor común de tumores de células germinales testiculares histológicamente heterogéneos, cuya frecuencia ha aumentado considerablemente en las últimas décadas y, en la actualidad, son la neoplasia maligna más común en varones adultos jóvenes. Usando la determinación de perfiles de expresión génica de una zona amplia del genoma, los presentes inventores han identificado más de 200 genes de expresión elevada en el CIS testicular, incluidas muchas neoplasias testiculares no comunicadas anteriormente. La expresión se verificó además mediante RT-PCR semicuantitativa y mediante hibridación in situ, y por inmunohistoquímica para algunos productos proteicos, para los que se disponía de anticuerpos. Descripción de la invención ES 2 365 466 T3 El biomarcador divulgado en el presente documento se puede usar para la detección de CIS y gonadoblastoma, además también se incluye en la presente invención el biomarcador AP-2 para la detección de los seminomas y no seminomas derivados de CIS y, por tanto, para la progresión del CIS. En una forma de realización, el marcador se indica en la SEC ID Nº 20. El biomarcador se identificó usando visualización diferencial y análisis en micromatriz de ADNc de genoma amplio y, posteriormente, se verificó mediante otros procedimientos, incluidas hibridación in situ, que mostró que los marcadores de CIS se expresaban en las células CIS. Para algunos biomarcadores, la localización en células CIS y en algunos tumores francos derivados de CIS también se realizó a nivel proteico mediante inmunohistoquímica. Por tanto, la presente invención se refiere al uso del biomarcador identificado, AP-2, para identificar el CIS y el estado de cánceres derivados de CIS en muestras humanas tales como muestras de semen, sangre, biopsias testiculares y biopsias de cualquier otro tejido humano. En un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la presencia de precursores de tumores de células germinales en una muestra de un individuo. Dicho procedimiento diagnóstico comprendería determinar el nivel de tránscritos de AP-2 en una muestra y concluir, a partir de dicho nivel de tránscritos, si la muestra contiene o no precursores de tumores de células germinales. Específicamente, el procedimiento comprende las etapas siguientes: a) determinar el nivel de tránscritos de un marcador en dicha muestra, en la que el marcador es AP-2; b) comparar dicho nivel de tránscritos con un nivel de referencia de tránscritos; c) identificar si el nivel de tránscritos es diferente a dicho nivel de referencia de tránscritos y evaluar si la muestra contiene precursores de tumores de células germinales si el nivel de tránscritos es diferente del nivel de referencia de tránscritos. En el presente contexto, la expresión precursores de tumores de células germinales se refiere al hecho habitualmente aceptado de que el CIS es un precursor común de todos los tumores de células germinales de adolescentes y adultos jóvenes. El CIS también se conoce como neoplasia de células germinales intratubulares del tipo no clasificado, neoplasia intraepitelial testicular y gonocitoma in situ, siendo el último término,... [Seguir leyendo]

1.- Un procedimiento para determinar la presencia de precursores de tumores de células germinales en una muestra, en el que dicho procedimiento comprende: a) determinar el nivel de tránscritos de un marcador en dicha muestra, en la que el marcador es AP-2; b) comparar dicho nivel de tránscritos con un nivel de referencia de tránscritos de dicho marcador en tejido testicular normal; c) identificar si el nivel de tránscritos es diferente a dicho nivel de referencia de tránscritos, y evaluar si la muestra contiene precursores de tumores de células germinales si el nivel de tránscritos es diferente del nivel de referencia de tránscritos. 2.- Un procedimiento para determinar la presencia de precursores de tumores de células germinales en una muestra, en el que dicho procedimiento comprende: a) determinar la señal de intensidad de la proteína codificada por un marcador en dicha muestra, en la que el marcador es AP-2; b) comparar la señal de intensidad con una señal de intensidad de referencia correspondiente de dicho marcador en tejido testicular normal; c) identificar si la señal de intensidad es diferente a dicha señal de intensidad de referencia correspondiente y evaluar si la muestra contiene precursores de tumores de células germinales si la señal de intensidad es diferente de la señal de intensidad de referencia correspondiente. 3.- Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el marcador se indica en la SEC ID Nº 20. 4.- Un procedimiento para monitorizar la progresión a partir de precursores de tumores de células germinales a células de cáncer franco en un individuo, que comprende: a) determinar el nivel de trnscritos de un marcador en una muestra, en la que el marcador es AP-2; b) comparar dicho nivel de tránscritos con un nivel de referencia de tránscritos de dicho marcador en tejido testicular normal; c) identificar si el nivel de tránscritos es diferente a dicho nivel de referencia de tránscritos, y evaluar la etapa de desarrollo de los precursores de tumores de células germinales a cáncer franco si el nivel de tránscritos es diferente del nivel de tránscritos de referencia. 5.- Un procedimiento para monitorizar la progresión a partir de precursores de tumores de células germinales a cáncer franco en un individuo, que comprende: a) determinar la señal de intensidad de la proteína codificada por un marcador en una muestra, en la que el marcador es AP-2; b) comparar la señal de intensidad con una señal de intensidad de referencia correspondiente de dicho marcador en tejido testicular normal; c) identificar si la señal de intensidad es diferente a dicha señal de intensidad de referencia correspondiente y evaluar la etapa de desarrollo de los precursores de tumores de células germinales a cáncer franco si la señal de intensidad es diferente de la correspondiente la señal de intensidad de referencia. 6.- Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en el que dicho procedimiento distingue seminoma de CIS. 7.- Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en el que dicho procedimiento distingue no seminoma de CIS. 8.- Un procedimiento de identificar precursores de tumores de células germinales en una muestra de un mamífero, ES 2 365 466 T3 en el que el procedimiento comprende analizar dicha muestra mediante un ensayo de detección cuantitativa y determinar el nivel de tránscritos y/o la señal de intensidad de un marcador, en el que dicho marcador es AP-2; comparar dicho nivel de tránscritos y/o la señal de intensidad con un valor de referencia de dicho marcador en tejido testicular normal; identificar si el nivel de tránscritos y/o la señal de intensidad del marcador de la muestra es significativamente diferente del valo de referencia, y evaluar si la muestra contiene precursores de tumores de células germinales si el nivel de tránscritos y/o la señal de intensidad es diferente del valor de referencia. 9.- Un procedimiento para determinar la presencia de precursores de tumores de células germinales en un individuo que comprende detectar la presencia de un producto de expresión, en el que dicho producto de expresión comprende una secuencia nucleotídica de AP-2 en una muestra aislada del individuo. 10.- Un procedimiento de evaluar la eficacia de una terapia para inhibir los precursores de tumores de células germinales en un sujeto, comprendiendo el procedimiento comparar el nivel de tránscitos de un marcador en una primer muestra obtenida del sujeto antes de proporcionar al menos una porción de la terapia al sujeto y el nivel de tránscritos del marcador en una segunda muestra obtenida del sujeto tras la administración de la parte de la terapia, en el que un nivel significativamente alterado de tránscritos del marcador en la segunda muestra, respecto a la primera muestra, es una indicación de que la terapia es eficaz para inhibir los precursores de tumores de células germinales en el sujeto, en el que el marcador es AP- 2. 11.- Un procedimiento de evaluar la eficacia de una terapia para inhibir los precursores de tumores de células germinales en un sujeto, comprendiendo el procedimiento comparar la señal de intensidad de la proteína codificada por un marcador en una primer muestra obtenida del sujeto antes de proporcionar al menos una porción de la terapia al sujeto y la señal de intensidad de la proteína codificada por el marcador en una segunda muestra obtenida del sujeto tras la administración de la parte de la terapia, en el que una señal de intensidad significativamente alterada de la proteína codificada por el marcador en la segunda muestra, respecto a la primera muestra, es una indicación de que la terapia es eficaz para inhibir los precursores de tumores de células germinales en el sujeto, en el que el marcador es AP-2. 12.- Un procedimiento para analizar la presencia de células madre indiferenciadas que con gran probabilidad vayan a progresar a precursores de tumores de células germinales y/o a cáncer en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento a) determinar el nivel de trnscritos de un marcador en una muestra, en la que el marcador es AP-2; b) comparar dicho nivel de tránscritos con un nivel de referencia de tránscritos de dicho marcador en tejido testicular normal; c) identificar si el nivel de tránscritos es diferente a dicho nivel de referencia de tránscritos, y evaluar si la muestra contiene células madre indiferenciadas que con gran probabilidad vayan a progresar a precursores de tumores de células germinales y/o a cáncer en el individuo si el nivel de tránscritos es diferente del nivel de referencia de tránscritos. 13.- Un procedimiento para analizar la presencia de células madre indiferenciadas que con gran probabilidad vayan a progresar a precursores de tumores de células germinales y/o a cáncer en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento a) determinar la señal de intensidad de la proteína codificada por un marcador en dicha muestra, en la que el marcador es AP-2, b) comparar la señal de intensidad con una señal de intensidad de referencia correspondiente de dicho marcador en tejido testicular normal; c) identificar si la señal de intensidad es diferente a dicha señal de intensidad de referencia correspondiente y evaluar si la muestra contiene células madre indiferenciadas que con gran probabilidad vayan a progresar a precursores de tumores de células germinales y/o a cáncer en el individuo si la señal de intensidad es diferente del 191 nivel de tránscritos de referencia. ES 2 365 466 T3 14.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la señal de intensidad se determina mediante detección inmunocitológica. 15.- Uso de un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 para la detección selectiva de la presencia de precursores de tumores de células germinales en un individuo de una población. 192 ES 2 365 466 T3 193 ES 2 365 466 T3 194 ES 2 365 466 T3 ES 2 365 466 T3 196 ES 2 365 466 T3 197 ES 2 365 466 T3 198 ES 2 365 466 T3 199 ES 2 365 466 T3 ES 2 365 466 T3 201 ES 2 365 466 T3 202 ES 2 365 466 T3 203