USO DE MATERIAL PARAMAGNÉTICO EN LA PURIFICACIÓN Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05112446.
Solicitante: BECTON, DICKINSON AND COMPANY.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1 BECTON DRIVE FRANKLIN LAKES, NEW JERSEY 074 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: COLLIS, MATTHEW P..
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 20 de Septiembre de 1999.
Fecha Concesión Europea: 28 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/10A2D
Clasificación PCT:
- C07H1/08 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 1/00 Procesos para la preparación de derivados de azúcar. › a partir de productos naturales.
- C07H21/04 C07H […] › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Países PCT: Alemania, España, Francia, Reino Unido, Italia.
Fragmento de la descripción:
Uso de material paramagnético en la purificación y manipulación de ácidos nucleicos.
Antecedentes de la invención
El acceso a los componentes celulares como ácidos nucleicos es imperativo para una diversidad de metodologías de biología molecular. Estas metodologías incluyen el secuenciado de ácido nucleicos, detección directa de secuencias particulares de ácidos nucleicos por hibridación de ácidos nucleicos y técnicas de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos.
La preparación y purificación de ADN plásmido de doble cadena (ds) de pureza elevada, ADN de fago de cadena única (ss), ADN cromosomal, fragmentos de ADN purificado por gel de agarosa y ARN es de importancia crítica en biología molecular. De forma ideal, un método para purificar ácidos nucleicos debe ser sencillo, rápido y requerir poca o ninguna manipulación adicional de muestras. Los ácidos nucleicos producidos por este método deben ser inmediatamente utilizables para transformación, análisis de restricción, ligado o secuenciado. Un método con todas estas características será extremadamente atractivo en la automatización de la preparación de muestras de ácidos nucleicos, un objetivo de los laboratorios de investigación y diagnóstico.
Normalmente, la preparación de ADN de plásmido a partir de precipitados en alcohol en bruto es laboriosa, muy a menudo utilizando gradientes de CsCl, filtración por gel, cromatografía de intercambio iónico o RNasa, proteinasa K y etapas repetidas de precipitación en alcohol. Estos métodos requieren también una considerable preparación de muestras posteriores para separar CsCl y otras sales, bromuro de etidio y alcohol. Se ofrecen argumentos similares cuando se usa cualquiera de estos métodos para purificar fragmentos de ADN. Un problema adicional con estos métodos es que con el ADN se pueden purificar conjuntamente componentes celulares pequeños con carga negativa. Por tanto, el ADN puede tener un nivel no deseable de contaminación.
Los ácidos nucleicos pueden ser purificados también usando fases sólidas. Las técnicas convencionales de extracción de fases sólidas han utilizado superficies que (1) no consiguen atraer ni mantener suficientes cantidades de moléculas de ácidos nucleicos debido a que el diseño de la superficie permite una fácil recuperación de las moléculas de ácidos nucleicos durante la elución, o bien (2) adhieren excesivamente moléculas de ácidos nucleicos a la superficie, obstaculizando así la recuperación de moléculas de ácidos nucleicos durante la elución. Las superficies metálicas convencionales que provocan estos problemas cuando son utilizadas en una extracción en fase sólida incluyen ciertas superficies de sílice como vidrio y Celite. La unión adecuada a ácidos nucleicos de estos tipos de superficies puede ser conseguida solamente utilizando concentraciones elevadas de caotropos o alcoholes que son generalmente tóxicos, cáusticos y/o caros. Por ejemplo, es conocido que el ADN se une a polvos de vidrio triturado y a filtros de fibra de vidrio en presencia de caotropos. Los iones caotrópicos normalmente son separados por lavado con alcohol, y los ADN son eluidos con soluciones de baja concentración salina o agua. De forma importante, el ARN o la proteína no se unen. Sin embargo, un inconveniente grave del uso de polvo de vidrio triturado es que su capacidad de unión es baja. Además, los polvos de vidrio a menudo adolecen de una recuperación inconsistente, incompatibilidad con tampones de boratos y tendencia a mellar ADN grandes. Otras sílices, como el gel de sílice y gránulos de sílice, no son adecuadas para la unión y recuperación de ADN. Actualmente, la fase sólida de elección para la extracción de la fase sólida de ADN es Celite como la encontrada en Prep-A-Gene® y Laboratorios Bio-Rad. Como con los polvos de vidrio triturado, son necesarias concentraciones elevadas de caotropos para una unión adecuada del ADN a la Celite.
Sin embargo, la hidratación de sustancias de sílice ha dado lugar en algunos casos a la eliminación de la necesidad de estas concentraciones elevadas de caotropos para eluir el ADN unido de la sustancia de sílice es expuesta en referencias como los documentos EP 0512767, EP 0585660, US 5.674.997 y EP 0832897.
Hay numerosos protocolos para purificar ADN. Por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.923.978 describe un procedimiento para purificar ADN en el que una solución de proteína y ADN se hace pasar sobre un soporte hidroxilado y seguidamente la proteína es unida y el ADN es eluido. La patente de EE.UU. 4.935.342 describe la purificación de ADN mediante la unión selectiva de ADN a intercambiadores aniónicos y posterior elución. La patente de EE.UU. 4.946.952 describe el aislamiento de ADN por precipitación con cetonas solubles en agua. Un procedimiento de purificación de ADN usando caotropos y ADN dializado es descrito en la patente de EE.UU. 4.900.677.
Se han utilizado también diátomos para la purificación de ácidos nucleicos, como evidencia la patente de EE.UU. nº 5.234.809 de Boom y cols. y la patente de EE.UU. nº 5.075.430 de Little y cols.
Todavía, una técnica adicional utilizada para la purificación de ácidos nucleicos es la unión a partículas paramagnéticas específicamente adaptadas. Ejemplos de estas técnicas se pueden encontrar en referencias como la memoria descriptiva europea EP 0446260 B1 y patente de EE.UU. 5.512.439 (Homes y cols.) que describen partículas superparamagnéticas monodispersas que tienen una desviación típica del tamaño de partículas de menos de 5%. Cada partícula porta una pluralidad de moléculas de un oligonucleótido, en la que cada oligonucleótido tiene una sección que sirve como una sonda para una molécula de ácido nucleico diana de interés.
La patente de EE.UU. nº 4.672.040 (Josephson) y la patente de EE.UU. nº 4.695.393 (Whitehead y cols.) describen partículas magnéticamente sensibles para ser usadas en sistemas para separar ciertas moléculas. Las partículas tienen un núcleo de óxido metálico rodeado por un revestimiento de silicona estable al que pueden estar acopladas moléculas orgánicas y/o biológicas.
El documento EP 0818461 describe un método para el aislamiento de ácido ribonucleico, que comprende disolver una muestra biológica en una solución ácida que contiene una sal de litio y un agente caotrópico, y poner en contacto la muestra biológica disuelta con partículas complejas hechas de un portador de unión a ácido nucleico, como sílice, y un material magnético.
El documento US 5.523.231 describe la precipitación de moléculas de ácidos nucleicos de una solución mediante la agregación alrededor de gránulos paramagnéticos.
La patente de EE.UU. nº 3.970.518 (Giaever) describe un método para clasificar y separar una población de células seleccionadas de una población de células mezcladas. El método utiliza partículas magnéticas pequeñas que están revestidas con un anticuerpo a las poblaciones de células seleccionadas.
La patente de EE.UU. nº 4.141.687 (Forrest y cols.) describe un aparato automático y un método para ensayar muestras de fluidos. El aparato utiliza un material en forma de partículas con un reactivo unido al mismo. El material en forma de partículas es magnético, y el reactivo es una sustancia que toma parte en una reacción en la mezcla de reacción.
La patente de EE.UU. nº 4.230.685 (Senyei y cols.) describe un método para la separación magnética de células. El método utiliza microesferas magnéticamente sensibles que están revestidas con Proteína A de estafilococos a la que está unido un anticuerpo.
La patente de EE.UU. nº 4.774.265 (Ugelstad y cols.) describe un procedimiento para preparar partículas polímeras magnéticas. Las partículas son partículas de polímero compactas o porosas tratadas con una solución de sales de hierro.
La patente de EE.UU. nº 5.232.782 (Charmot) describe microesferas magnetizables de "núcleo-corteza" que tienen un núcleo de relleno magnetizable un una corteza de organopolisiloxano reticulado.
La patente de EE.UU. nº 5.395.688 (Wang y cols.) describe partículas polímeras fluorescentes magnéticamente sensibles que tienen un núcleo polímero revestido uniformemente con una capa de óxido metálico magnéticamente sensible que contiene polímero.
La patente de EE.UU. nº 5.491.068 y la patente de EE.UU. nº 5.695.946 (Benjamin y cols.) describen un método de ensayo para detectar la presencia...
Reivindicaciones:
1. Uso de al menos una partícula de unión a ácido nucleico que consiste sólo en material paramagnético en una solución ácida para enlazar electrostáticamente de manera reversible directamente al menos una molécula de ácido nucleico en la solución ácida.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el material paramagnético comprende hierro.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el material paramagnético se selecciona del grupo que consiste en óxido de hierro, sulfuro de hierro y cloruro de hierro.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el óxido de hierro es hidróxido férrico u óxido ferroso-férrico.
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