TERAPIA PARA EL CANCER CON PARVOVIRUS Y COMBINACIÓN CON QUIMIOTERAPIA.

Terapia para el cáncer con parvovirus y combinación con quimioterapia La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende (a) un parvovirus y (b) un agente quimioterapéutico y al uso de dicha composición para el tratamiento del cáncer, por ejemplo un tumor cerebral o cáncer de páncreas. El adenocarcinoma ductal pancreático (ACDP) es una de las neoplasias malignas gastrointestinales más letales. El ACDP es la cuarta causa más frecuente de muertes relacionadas con cáncer en Norteamérica, la sexta en Europa y la quinta en el Reino Unido. [1, 2] La enfermedad es muy resistente a los tratamientos disponibles en la actualidad. La resección quirúrgica proporciona la mejor posibilidad de supervivencia a largo plazo, pero únicamente es viable en una minoría de pacientes y no está exenta de riesgo. [3] En la enfermedad avanzada, cuando la cirugía no es una opción, la quimioterapia entra en juego usando, en concreto, gemcitabina o 5-FU (5-fluorouracilo), aunque los efectos todavía son modestos y siempre se acompañan de una toxicidad general alta. [4] La gemcitabina ha sido aprobada por la FDA como terapia de primera línea para pacientes con cáncer de páncreas metastásico o localmente avanzado. Este fármaco es un análogo de la desoxicitidina dependiente del ciclo celular de la clase de los antimetabolitos que es transportado al interior de las células por transportadores nucleosídicos equilibradores humanos (hENT) y se fosforila en su forma trifosfato activa por acción de la desoxicitidina quinasa (dCK). Un motivo de preocupación importante con la terapia de gemcitabina reside en el desarrollo de resistencia a este quimioterapéutico. Esta resistencia se puede deber a la menor importación/fosforilación del fármaco y/o a la mayor exportación desde la célula a través de los miembros de la familia de transportadores ABC, MDR y MRP1/2, lo que tiene como resultado la depleción del conjunto intracelular de gemcitabina activada .[5] Se están explorando combinaciones de gemcitabina con otros regímenes terapéuticos para mejorar el efecto anticanceroso erradicando las variantes resistentes o para permitir la reducción de las dosis de quimioterapia y su toxicidad consiguiente. La terapia del cáncer usando virus o derivados de vectores armados que matan específicamente las células transformadas neoplásicamente (onicolisis) es un nuevo enfoque al tratamiento de esta enfermedad mortal.[6] Algunos parvovirus autónomos pertenecen a la categoría de los denominados virus oncolíticos.[7] algunos parvovirus son partículas pequeñas (25-30 nm) sin cubierta que contienen un genoma de ADN monocatenario de 5,1 kb desde el que se expresan dos proteínas no estructurales (NS1, NS2) y dos de la cápsida (VP1, VP2). [8] El parvovirus H-1PV tiene la única ventaja de desencadenar un proceso de muerte distinto, al menos en tumores cerebrales y en algunos otros tumores, a saber, la recolocación citosólica y la activación de las proteasas lisosómicas (catepsinas). [12] Varios miembros del género parvovirus (H-1PV, MVM, Lull), cuyos huéspedes naturales son los roedores, están actualmente siendo considerados para aplicaciones en terapia génica del cáncer debido a su fracaso para transformar las células huésped, la capacidad de producir infección asintomática de seres humanos y la habilidad para propagarse preferentemente (oncotropismo) y matar (oncolisis) células transformadas neoplásicamente. [9,10,24] Se ha demostrado que los virus MVMp y H-1PV ejercen actividades oncosupresoras in vivo, es decir son capaces de inhibir la formación de tumores espontáneos química o víricamente inducidos en animales de laboratorio. Los vectores basados en un casete de expresión de parvovirus conservan las características oncotrópicas de los virus silvestres. [11] A pesar de los impresionantes resultados conseguidos, la eficacia anticancerosa de los candidatos de parvovirus más prometedores para las aplicaciones clínicas en humanos (incluido el H-1PV) tienen que mejorarse, por ejemplo en lo que respecta a la prolongación del ciclo de vida tras el diagnóstico. Además, se sabe que los vectores de parvoviridae se pueden emplear como vehículo con el fin de introducir un ácido nucleico supresor tumoral, es decir un gen supresor tumoral, en un paciente que sufre cáncer [25]. Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un medio para una terapia mejor a base de parvovirus. De acuerdo con la invención, esto se consigue mediante las materias objeto definidas en las reivindicaciones. La presente invención se basa en los hallazgos del solicitante de que, mediante el tratamiento combinado con un parvovirus y un agente quimioterapéutico como gemcitabina (siendo el quimioterapéutico más potente para el cáncer de páncreas y otros tipos de cáncer hasta la fecha, pero todavía tiene un perfil de toxicidad elevada), la toxicidad de este fármaco podría reducirse y mejorarse la eficiencia terapéutica. Se implantaron tumores pancreáticos ortotópicamente en ratas de Lewis y se trataron con gemcitabina, H-1PV o ambos, combinados en diferentes regímenes terapéuticos. El tamaño del tumor se monitorizó mediante tomografía computerizada, mientras que las funciones de la médula ósea, el hígado y el riñón se controlaron mediante los niveles de marcadores clínicamente relevantes. Las líneas de células pancreáticas y sus derivados resistentes a gemcitabina se analizaron in vitro para determinar la sensibilidad a H-1PV o la correspondiente combinación del fármaco. Se pudo mostrar que la gemcitabina, seguida de la inyección intratumoral de H-1PV, condujo a un retraso del crecimiento tumoral, ausencia de metástasis en la TC y prolongación de la supervivencia de los animales. La detección selectiva toxicológica mostró que el H-1PV no producía ningún daño orgánico adicional tras la combinación con gemcitabina. 2   En estudios in vitro demostraron que, a pesar del efecto negativo de la gemcitabina sobre la replicación del parvovirus, la combinación sumó de forma sinérgica el efecto de cada tratamiento. Las células resistentes permanecieron sensibles a la muerte por H-1PV y pudieron conservar la expresión viral en presencia de gemcitabina. Se obtuvieron resultados comparables con el tratamiento de gliomas usando una combinación de parvovirus y el fármaco quimioterapéutico temzolomida. Por tanto, los parvovirus tienen un tremendo potencial terapéutico para tratar cánceres como ACDP y gliomas, preferentemente en combinación con quimioterapia en un protocolo de dos etapas. Descripción breve de las figuras Figura 1: Sensibilidad de líneas celulares de ACDP a los efectos tóxicos de H-1PV solo o combinado con gemcitabina (A) Capacidad residual de formación de colonias de las células Panc-1 y BxPC-3 tras la infección por H-1PV a las MOI indicados. Las colonias se contaron tras tinción con cristal violeta y la supervivencia se presenta como el porcentaje de células tratadas de forma simulada. (B) Muerte de las células mencionadas anteriormente tratadas con concentraciones crecientes de gemcitabina, seguido 24 horas más tarde de infección por H-1PV a una MOI de 10 ufc/célula. La supervivencia celular se midió mediante ensayos MTT realizados 72 horas después de la infección en comparación con cultivos tratados de forma simulada (100 %) y se expresó de forma inversa como muerte celular. Se indican los valores medios y las barras de SD de 3 experimentos independientes llevados a cabo por triplicado. Figura 2: Caracterización de líneas celulares resistentes a gemcitabina y su sensibilidad al H-1PV A, Expresión de marcadores de resistencia a fármacos en células Panc-1 y BxPC-3 parentales (-) y resistentes a gemcitabina ( R ), medida mediante RT-PCR. Los niveles de transcripción de ß-actina sirvieron como referencia. B, Micrografías de células Panc-1 y BxPC-3 resistentes a gemcitabina ( R ), infectadas (H-1PV) o no (simulado) con H- 1PV a una MOI = 10 UR/célula (aumento 40x). C, Sensibilidad de las células Panc-1 (parte superior) y BxPC-3 (parte inferior) resistentes a gemcitabina ( R ) y parentales a H-1PV frente al tratamiento con gemcitabina. Las células se sembraron a una densidad de 2 x 10 3 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con H-1PV (10 UR/célula, columnas de H-1PV) o con gemcitabina (40 ng/ml), columnas de gemcitabina. Se realizaron ensayos de citotoxicidad MTT 144 horas después del tratamiento. Se muestran los resultados de 3 experimentos independientes. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con un asterisco (* para P < 0,05, y ** para P < 0,005). D, Transducción de EGFP por un H-1PV recombinante en células Panc-1 y Panc-1 R . Los cultivos se trataron (parte inferior) o no (parte superior) con gemcitabina (40 ng/ml) y se infectaron de forma concomitante con el vector vital (5 UR/célula).... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que contiene un virus del género parvovirus y un agente quimioterapéutico, en la que el agente quimioterapéutico es gemcitabina o temozolodina.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, que contiene (a) el parvovirus y (b) el agente 5 quimioterapéutico como entidades separadas.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que dicho parvovirus es H1 (H1PV) o un parvovirus relacionado de roedores, en la que dicho parvovirus relacionado de roedores es Lulll, virus diminuto del ratón (MMV) , parvovirus del ratón (MPV) , virus diminuto de la rata (RMV) , parvovirus de la rata (RPV) o virus de la rata (RV) .

4. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer.

5. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicho cáncer es un tumor cerebral o cáncer pancreático.

6. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho cáncer pancreático 15 es adenocarcinoma ductal pancreático (ACDP) .

7. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho tumor cerebral es un glioma, meduloblastoma o meningioma.

8. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho glioma es un glioblastoma humano maligno.

9. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en la que dicho parvovirus se administra mediante administración intratumoral.