SUSTRATO CROMOGÉNICO CON UN COLORANTE INDICADOR DE PH.

La presente invención se refiere al uso de una composición para un ensayo ligado a enzimas que comprende un sustrato cromogénico que produce un color detectable con una absorbancia máxima a una longitud de onda en reacciones del ensayo que contienen la enzima y un colorante indicador de pH que produce un color detectable con una absorbancia máxima a una segunda longitud de onda cuando el pH de las reacciones del ensayo se cambia para terminar las reacciones, para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ensayo. El sustrato cromogénico permite la detección colorimétrica de una sustancia con capacidad para unirse en reacciones positivas del ensayo y el colorante indicador de pH permite que las reacciones negativas del ensayo puedan distinguirse colorimétricamente de reacciones falsas negativas. Preferiblemente, se usa la composición en inmunoensayos ligados a enzimas tales como los ELISA. Lo más preferiblemente, la enzima es una peroxidasa. En una realización preferida adicional, el sustrato cromogénico es 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB) y el colorante indicador de pH se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en rojo de cresol y púrpura de m-cresol. (2) Descripción de la técnica relacionada ES 2 367 547 T3 Los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) son los inmunoensayos utilizados más comúnmente para una gran variedad de aplicaciones en diagnóstico, investigación, pruebas en alimentos, control de calidad y garantía de calidad de procesos, y pruebas medioambientales. Los ELISA utilizan una enzima de marcaje y un sustrato para la enzima para producir una señal detectable para cuantificar antígenos, haptenos o anticuerpos. La sensibilidad de los ELISA depende de la combinación de sustrato y enzima de marcaje particular usada. Se ha encontrado que la peroxidasa de rábano (HRP) es muy adecuada para su uso como una enzima de marcaje en los ELISA porque es altamente específica, sensible y muy estable en la catalización de reacciones cromogénicas, de luminiscencia y de fluorescencia. Para aumentar la sensibilidad de los ELISA ligados a peroxidasa, se usan sustratos cromogénicos incoloros o ligeramente incoloros. Estos sustratos cromogénicos incluyen 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB), diclorhidrato de orto-fenilendiamina (OPD), y sal de diamonio del ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). El documento WO 93/25905 da a conocer un método de inmunoensayo que utiliza un indicador de pH para evaluar si se añadió una muestra a la reacción para evitar resultados falsos negativos. La patente estadounidense n. o 4.503.143 concedida a Gerber et al. da a conocer ELISA y otros inmunoensayos que usan TMB como sustrato cromogénico. La patente estadounidense n. o 5.206.150 concedida a Tai da a conocer disoluciones de TMB a base de agua. Los sustratos cromogénicos incoloros reducen la señal de fondo lo que aumenta la sensibilidad total del ensayo. Sin embargo, un problema asociado con el uso de sustratos cromogénicos incoloros es que durante la dispensación de un sustrato incoloro en una pluralidad de tubos o pocillos transparentes de una placa de ELISA, es difícil determinar inmediatamente mediante examen visual si el sustrato cromogénico se añadió a un tubo o pocillo particular o no. Como consecuencia, en algunos casos puede no añadirse el sustrato cromogénico a algunos tubos o pocillos o añadirse dos veces a algunos tubos o pocillos. Un segundo problema asociado con el uso de sustratos cromogénicos incoloros es determinar si una reacción negativa es negativa porque la muestra para la reacción no contenía el analito que está sometiéndose a prueba o es negativa porque se omitieron uno o más reactivos necesarios para la reacción, por ejemplo el sustrato cromogénico incoloro. El segundo problema es particularmente grave en los ELISA ligados a peroxidasa que incluyen una parada con ácido tras la oxidación del sustrato cromogénico. Dado que no es posible distinguir estos falsos negativos debido a una parada con ácido o muestra omitida de negativos reales debido a la ausencia del analito en la muestra u otros falsos negativos provocados por algunos otros fallos en la reacción tales como muestra omitida o analito degradado en una muestra, el número de reacciones negativas en un ensayo se eleva artificialmente. Se dio a conocer una solución al primer problema en la patente estadounidense n. o 6.221.624 B1 concedida a Lihme y Wikborg que describe una composición previamente teñida que comprende TMB y un colorante visible tal como floxina B, púrpura de m-cresol, o similares. El colorante se usa a una concentración que imparte un color a una disolución que contiene la composición que es visible a simple vista. La disolución coloreada permite al usuario determinar visualmente que el sustrato cromogénico está o se ha añadido a un tubo o pocillo de una placa de ELISA durante el pipeteo. El colorante se selecciona preferiblemente para que no tenga absorbancia en el intervalo de absorbancia en las condiciones a las que debe detectarse el producto de reacción de la reacción entre el sustrato cromogénico y la enzima y que no tenga sustancialmente ninguna influencia sobre la reacción enzima-sustrato cromogénico. El colorante preferido es floxina B que se usa a una concentración que proporciona un visible cuando se añade a una reacción de peroxidasa. La mayoría de inmunoensayos a base de peroxidasa usan una parada con ácido para terminar las reacciones de peroxidasa porque la parada con ácido estabiliza el producto oxidado aumentando así la sensibilidad del ensayo. La floxina B se vuelve incolora cuando se añade una parada con ácido a la reacción. Por tanto, la composición anterior que comprende floxina B o colorantes similares no permite al usuario, después de completarse las reacciones, determinar si una reacción negativa es un negativo real provocado por una ausencia de analito en la muestra o un falso negativo provocado por una omisión de la composición cromogénica. 2 El segundo problema no se ha tratado. Por tanto, sigue habiendo una necesidad de un método que permita distinguir las reacciones negativas reales (ausencia de analito en la muestra) de falsos negativos provocados por omisión de reactivos de reacción particulares en inmunoensayos ligados a peroxidasa tales como los ELISA al tiempo que no interfiera con reacciones positivas. SUMARIO DE LA INVENCIÓN ES 2 367 547 T3 El objeto de la presente invención se define en las reivindicaciones. A continuación en el presente documento se describen realizaciones preferidas adicionales. Se proporciona una composición que comprende un sustrato cromogénico con una absorbancia a una longitud de onda y un colorante indicador de pH con una absorbancia a una segunda longitud de onda. La composición permite tanto la detección de una sustancia con capacidad para unirse como la confirmación de reacciones negativas reales en ensayos ligados a enzimas, particularmente inmunoensayos ligados a enzimas tales como los ELISA. En particular, el sustrato cromogénico permite la detección colorimétrica de la sustancia con capacidad para unirse en reacciones positivas del ensayo y el colorante indicador de pH permite distinguir colorimétricamente reacciones negativas reales de los usos de una composición tal como para el uso en (inmuno)ensayos ligados a enzimas, preferiblemente en un ensayo de inmunoabsorción (ELISA) y para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ELISA, que comprende en una mezcla: (a) un sustrato cromogénico que es oxidable por un peróxido generado en el ELISA en una mezcla de reacción a la que se le añade posteriormente una disolución de parada para detener la reacción para formar un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda; y (b) un colorante indicador de pH que es incoloro o tiene un color que es esencialmente no detectable a simple vista cuando se aplica la composición a un recipiente de reacción para el ELISA pero que produce un segundo color detectable a simple vista y que tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada ácida o básica a la composición en el recipiente de reacción ensayo de reacciones falsas negativas. Lo siguiente ilustra varias de las realizaciones preferidas de la presente invención. La presente invención proporciona un método para detectar un analito en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas a base de peroxidasa (ELISA) para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ELISA, que comprende: (a) proporcionar una composición que comprende una mezcla de un sustrato cromogénico que es oxidable mediante peróxido en una reacción para el ELISA catalizada mediante la peroxidasa del ELISA para formar un primer color con una absorbancia a una primera longitud de... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un analito en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) basado en peroxidasa y distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ELISA, que comprende: (a) proporcionar una composición que comprende una mezcla de un sustrato cromogénico que es oxidable mediante peróxido en una reacción para el ELISA catalizada por la peroxidasa del ELISA para formar un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda, un colorante indicador de pH que forma un segundo color que es detectable a simple vista y tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada a la composición en un recipiente de reacción, y un peróxido; (b) añadir una alícuota de la composición a cada uno de los recipientes de reacción para el ELISA para formar una mezcla de reacción; (c) incubar la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para oxidar el sustrato cromogénico al primer color; (d) añadir la disolución de parada a la mezcla de reacción para detener la reacción y generar el segundo color; y (e) medir espectrográficamente las absorbancias a la primera y segunda longitudes de onda, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica la detección del analito, absorbancia sólo a la segunda longitud de onda indica la reacción negativa, y ausencia de absorbancia a la primera y segunda longitudes de onda indica la reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la composición y la disolución de parada. 2. El método según la reivindicación 1, en el que el indicador de pH es incoloro o tiene un color que es esencialmente no detectable a simple vista cuando se aplica la composición a un recipiente de reacción para el ELISA pero que forma el segundo color que es detectable a simple vista y tiene la absorbancia a la segunda longitud de onda cuando se añade la disolución de parada a la composición en el recipiente de reacción. 3. El método según la reivindicación 1, en el que la disolución de parada es un ácido y el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), 3,3-dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN), y 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). 4. El método según la reivindicación 1, en el que la disolución de parada es un ácido y el sustrato cromogénico es ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). 5. El método según la reivindicación 1, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 6. El método según la reivindicación 1, en el que la disolución de parada es una base y el sustrato cromogénico es ácido 5-aminosalicílico (5AS). 7. El método según la reivindicación 6, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en fenolftaleína, timolftaleína, amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 8. El método según la reivindicación 1, en el que el ELISA se selecciona del grupo que consiste en ELISA directo, indirecto y competitivo. 9. El método según la reivindicación 1, en el que el sustrato cromogénico es 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). 10. El método según la reivindicación 9, en el que el colorante indicador de pH es púrpura de m-cresol. 11. El método según la reivindicación 9, en el que la primera longitud de onda es de aproximadamente 450 nm y la segunda longitud de onda es superior a 500 nm. 12. El método según la reivindicación 3 ó 4, en el que el ácido se selecciona del grupo que consiste en HCl, H2SO4 y H2PO4. 13. Uso de un inmunoensayo enzimático para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el inmunoensayo y en el que el inmunoensayo es para la detección colorimétrica de un analito de un 17 ES 2 367 547 T3 tipo en el que se adsorbe una cantidad de un primer anticuerpo en un soporte sólido en un recipiente de reacción; se forma un conjugado entre un reactivo inmunológico y una peroxidasa; se mezcla el conjugado con una muestra que va a someterse a prueba para detectar el analito, el analito se une al primer anticuerpo y al conjugado para formar un complejo inmunológico en fase sólida; y se determina la cantidad del analito midiendo la reacción del complejo inmunológico con un sustrato cromogénico oxidable mediante peróxido y la peroxidasa, que comprende: (a) proporcionar una disolución líquida que comprende el sustrato cromogénico, peróxido y un colorante indicador de pH, en la que el sustrato cromogénico es oxidable a un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda y el colorante indicador de pH produce un segundo color es detectable a simple vista y que tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada al recipiente de reacción que contiene la disolución líquida; (b) mezclar la disolución líquida con el complejo inmunológico en el recipiente de reacción para formar una mezcla de reacción que oxida el sustrato cromogénico al primer color; (c) añadir la disolución de parada a la mezcla de reacción en el recipiente de reacción para producir el segundo color; y, (d) medir espectrográficamente las absorbancias a las primera y segunda longitudes de onda, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica detección del analito, absorbancia a la segunda longitud de onda indica una reacción negativa, y una ausencia de absorbancia a la primera y segunda longitud de onda indica una reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la disolución líquida y la disolución de parada. 14. Uso según la reivindicación 13, en el que el indicador de pH es incoloro o tiene un color que es esencialmente no detectable a simple vista cuando se aplica la composición a un recipiente de reacción para el ELISA pero que forma el segundo color que es detectable a simple vista y tiene la absorbancia a la segunda longitud de onda cuando se añade la disolución de parada a la composición en el recipiente de reacción. 15. Uso según la reivindicación 13, en el que la disolución de parada es un ácido y el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), 3,3-dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN), y 3,3,5,5tetrametilbencidina (TMB). 16. Uso según la reivindicación 13, en el que la disolución de parada es un ácido y el sustrato cromogénico es ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). 17. Uso según la reivindicación 13, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 18. Uso según la reivindicación 13, en el que la disolución de parada es una base y el sustrato cromogénico es ácido 5-aminosalicílico (5AS). 19. Uso según la reivindicación 18, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en fenolftaleína, timolftaleína, amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 20. Uso según la reivindicación 13, en el que el sustrato cromogénico es 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). 21. Uso según la reivindicación 20, en el que el colorante indicador de pH es púrpura de m-cresol. 22. Uso según la reivindicación 20, en el que la primera longitud de onda es de aproximadamente 450 nm y la segunda longitud de onda es superior a 500 nm. 23. Uso según la reivindicación 15 ó 16, en el que el ácido se selecciona del grupo que consiste en HCl, H2SO4 y H2PO4. 24. Uso de un inmunoensayo enzimático para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el inmunoensayo y en el que el inmunoensayo es para la detección colorimétrica de un anticuerpo de un tipo en el que se adsorbe una cantidad de un analito en un soporte sólido en un recipiente de reacción; se forma un conjugado entre un reactivo inmunológico y una peroxidasa; se mezcla el conjugado con una muestra que va a someterse a prueba para detectar el anticuerpo, el anticuerpo se une al analito y al conjugado para formar un complejo inmunológico en fase sólida; y se determina la cantidad del anticuerpo midiendo la reacción del complejo inmunológico con un sustrato cromogénico oxidable mediante peróxido y la peroxidasa, que comprende: 18 ES 2 367 547 T3 (a) proporcionar una disolución líquida que comprende el sustrato cromogénico, peróxido y un colorante indicador de pH, en la que el sustrato cromogénico es oxidable a un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda y el colorante indicador de pH produce un segundo color que es detectable a simple vista y que tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada al recipiente de reacción que contiene la disolución líquida; (b) mezclar la disolución líquida con el complejo inmunológico en el recipiente de reacción para formar una mezcla de reacción que oxida el sustrato cromogénico al primer color; (c) añadir la disolución de parada a la mezcla de reacción en el recipiente de reacción para producir el segundo color; y, (d) medir espectrográficamente las absorbancias a la primera y segunda longitudes de onda, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica detección del analito, absorbancia a la segunda longitud de onda indica una reacción negativa, y una ausencia de absorbancia a la primera y segunda longitudes de onda indica a una reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la disolución líquida y la disolución de parada. 25. Uso según la reivindicación 24, en el que el indicador de pH es incoloro o tiene un color que es esencialmente no detectable a simple vista cuando se aplica la composición a un recipiente de reacción para el ELISA pero que forma el segundo color que es detectable a simple vista y tiene la absorbancia a la segunda longitud de onda cuando se añade la disolución de parada a la composición en el recipiente de reacción. 26. Uso según la reivindicación 24, en el que la disolución de parada es un ácido y el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), 3,3-dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN), y 3,3,5,5tetrametilbencidina (TMB). 27. Uso según la reivindicación 24, en el que la disolución de parada es un ácido y el sustrato cromogénico es ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). 28. Uso según la reivindicación 24, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 29. Uso según la reivindicación 24, en el que la disolución de parada es una base y el sustrato cromogénico es ácido 5-aminosalicílico (5AS). 30. Uso según la reivindicación 24, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en fenolftaleína, timolftaleína, amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 31. Uso de un inmunoensayo enzimático según la reivindicación 24, en el que el sustrato cromogénico es 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). 32. Uso según la reivindicación 31, en el que el colorante indicador de pH es púrpura de m-cresol. 33. Uso según la reivindicación 31, en el que la primera longitud de onda es de aproximadamente 450 nm y la segunda longitud de onda es superior a 500 nm. 34. Uso según la reivindicación 31, en el que el ácido se selecciona del grupo que consiste en HCl, H2SO4 y H2PO4. 35. Uso de un kit para detectar un analito en un ensayo ligado a enzimas y distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ensayo, que comprende: uno o más primeros recipientes cada uno de los cuales contiene una mezcla de un sustrato cromogénico con una absorbancia a una primera longitud de onda, un colorante indicador de pH adecuado para el uso con el sustrato cromogénico, que produce un color detectable a simple vista que tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada ácida o básica a la mezcla en el recipiente de reacción, y un peróxido, en el que las absorbancias a la primera y segunda longitudes de onda se miden espectrográficamente, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica detección del analito, absorbancia a la segunda longitud de onda indica una reacción negativa, y una ausencia de absorbancia a la primera y segunda longitud de onda indica una reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la disolución líquida y la disolución de parada. 19 ES 2 367 547 T3 36. Uso según la reivindicación 35, en el que el indicador de pH es incoloro o tiene un color que es esencialmente no detectable a simple vista cuando se aplica la composición a un recipiente de reacción para el ensayo pero que forma el segundo color que es detectable a simple vista y tiene la absorbancia a la segunda longitud de onda cuando se añade la disolución de parada a la composición en el recipiente de reacción. 37. Uso según la reivindicación 35, en el que el primer recipiente contiene el sustrato cromogénico y el colorante indicador de pH, y un segundo recipiente contiene el peróxido. 38. Uso según la reivindicación 35 ó 36, en el que el kit incluye además un tercer recipiente que contiene una disolución de parada ácida o básica. 39. Uso según la reivindicación 35, en el que el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), 3,3-dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN), y 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). 40. Uso según la reivindicación 35, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, rojo de quinaldina, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 41. Uso según la reivindicación 35, en el que el sustrato cromogénico es ácido 5-aminosalicílico (5AS). 42. Uso según la reivindicación 41, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en fenolftaleína, timolftaleína, amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 43. Uso según la reivindicación 35, en el que el colorante indicador de pH es púrpura de m-cresol y el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB) y ácido 2,2azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). 44. Uso según la reivindicación 35, en el que el ensayo ligado a enzimas es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). 45. Uso según la reivindicación 35, en el que el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), y 3,3-dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN) que se convierte mediante una enzima en un recipiente de reacción para el ensayo a un primer color. 46. Uso según la reivindicación 45, en el que el sustrato cromogénico es fosfato de p-nitrofenilo. 47. Uso según la reivindicación 46, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 48. Uso de una composición para el uso en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ELISA, que comprende en una mezcla: (a) un sustrato cromogénico que es oxidable por un peróxido generado en el ELISA en una mezcla de reacción a la que se le añade posteriormente una disolución de parada para detener la reacción para formar un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda; y (b) un colorante indicador de pH que es incoloro o tiene un color que es esencialmente no detectable a simple vista cuando se aplica la composición a un recipiente de reacción para el ELISA pero que produce un segundo color detectable a simple vista y que tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada ácida o básica a la composición en el recipiente de reacción, en el que las absorbancias a las primera y segunda longitudes de onda se miden espectrográficamente, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica la detección del analito, absorbancia a la segunda longitud de onda indica una reacción negativa y una ausencia de absorbancia a las primera y segunda longitud de onda indica una reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la disolución líquida y la disolución de parada. 49. Uso según la reivindicación 48, en el que el sustrato cromogénico se selecciona del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), y 3,3-dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN). 50. Uso según la reivindicación 49, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, rojo de quinaldina, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 51. Uso según la reivindicación 48, en el que el sustrato cromogénico es ácido 5-aminosalicílico (5AS). ES 2 367 547 T3 52. Uso según la reivindicación 51, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en fenolftaleína, timolftaleína, amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 53. Uso según la reivindicación 48, en el que el colorante indicador de pH es púrpura de m-cresol y el sustrato cromogénico es ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS). 54. Uso según la reivindicación 48, en el que el sustrato cromogénico es 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). 55. Uso según la reivindicación 54, en el que el colorante indicador de pH es púrpura de m-cresol. 56. Un método para detectar un analito en un ensayo ligado a enzimas y distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ensayo, que comprende: (a) proporcionar una composición que comprende una mezcla de un sustrato cromogénico seleccionado del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), y 3,3-dimetiloxibencidina (ortodianisidina u ODN) que se convierte mediante una enzima en un recipiente de reacción para el ensayo a un primer color que tiene una absorbancia a una primera longitud de onda y un colorante indicador de pH que produce un segundo color detectable a simple vista y que tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada ácida o básica a la composición en el recipiente de reacción; (b) añadir una alícuota de la composición al recipiente de reacción para el ensayo ligado a enzimas para formar una mezcla de reacción; (c) incubar la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para producir el primer color; (d) añadir la disolución de parada a la mezcla de reacción para detener la reacción y generar el segundo color con la segunda longitud de onda; y (e) medir espectrográficamente absorbancias a la primera y segunda longitudes de onda, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica la detección del analito, absorbancia sólo a la segunda longitud de onda indica la reacción negativa, y ausencia de absorbancia a las primera y segunda longitudes de onda indica la reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la composición y la disolución de parada. 57. El método según la reivindicación 56, en el que la enzima es una fosfatasa alcalina, el sustrato cromogénico es fosfato de p-nitrofenilo, y la disolución de parada es una base. 58. El método según la reivindicación 57, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 59. El método según la reivindicación 56, en el que el ensayo es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). 60. El método según la reivindicación 56 ó 59, en el que el ensayo se selecciona del grupo que consiste en ensayo directo, indirecto y competitivo. 61. El método según la reivindicación 60, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 62. Uso de una composición para el uso en un ensayo ligado a enzimas y para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el ensayo, que comprende en una mezcla: (a) un sustrato cromogénico seleccionado del grupo que consiste en orto-fenilendiamina (OPD), ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diaminobencidina (DAB), y 3,3dimetiloxibencidina (orto-dianisidina u ODN) que se convierte mediante una enzima en un recipiente de reacción para el ensayo a un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda; y (b) un colorante indicador de pH que produce un segundo color detectable a simple vista y tiene una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada ácida o básica a la composición en el recipiente de reacción; en el que las absorbancias a la primera y segunda longitudes de onda se miden espectrográficamente, en el que absorbancia a la primera longitud de onda indica detección del analito, absorbancia a la segunda longitud de onda indica una reacción negativa y una ausencia 21 ES 2 367 547 T3 de absorbancia a la primera y segunda longitudes de onda indica una reacción falsa negativa o detectar el segundo color a simple vista en el que el segundo color indica que la mezcla de reacción contiene la disolución líquida y la disolución de parada. 63. Uso según la reivindicación 62, en el que el sustrato cromogénico es fosfato de p-nitrofenilo. 64. Uso según la reivindicación 63, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en amarillo de alizarina R, carmín de índigo y combinaciones de los mismos. 65. Uso según la reivindicación 62, en el que el colorante indicador de pH se selecciona del grupo que consiste en rojo de cresol, púrpura de m-cresol, amarillo de metanilo, 4-fenilazodifenilamina, verde de malaquita, naranja IV, 2,2,2,4,4-pentametoxitrifenil-carbinol y combinaciones de los mismos. 66. Uso de un inmunoensayo enzimático para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el inmunoensayo y en el que el inmunoensayo es para la detección colorimétrica de un analito de un tipo en el que se adsorbe una cantidad de un primer anticuerpo en un soporte sólido en un recipiente de reacción; se forma un conjugado entre un reactivo inmunológico y una peroxidasa; se mezcla el conjugado con una muestra que va a someterse a prueba para detectar el analito, el analito se une al primer anticuerpo y al conjugado para formar un complejo inmunológico en fase sólida; y se determina la cantidad del analito midiendo la reacción del complejo inmunológico con un sustrato cromogénico oxidable mediante peróxido y la peroxidasa, que comprende: (a) proporcionar una disolución líquida que comprende el sustrato cromogénico, peróxido, y un colorante indicador de pH , en la que el sustrato cromogénico es TMB u OPD y es oxidable a un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda cuando se forma una mezcla de reacción entre la disolución líquida y el complejo inmunológico y es oxidable adicionalmente del primer color a un segundo color con una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada al recipiente de reacción y el colorante indicador de pH produce un tercer color que es detectable a simple vista y tiene una absorbancia a una tercera longitud de onda cuando se añade una disolución de parada al recipiente de reacción que contiene la disolución líquida; (b) mezclar la disolución líquida con el complejo inmunológico en el recipiente de reacción para formar una mezcla de reacción que oxida el sustrato cromogénico al primer color; (c) añadir la disolución de parada a la mezcla de reacción en el recipiente de reacción para producir el segundo y tercer colores; y, (d) medir espectrográficamente las absorbancias a las primera, segunda y tercera longitudes de onda, en el que se detecta una reacción positiva mediante absorbancia a la segunda longitud de onda, reacciones que no tienen absorbancia a la primera o segunda longitud de onda, pero tienen absorbancia a la tercera longitud de onda se clasifican como negativas, y en el que todas las reacciones sin absorbancia a la tercera longitud de onda se clasifican como falsas negativas. 67. Uso de un inmunoensayo enzimático para distinguir una reacción negativa de una reacción falsa negativa en el inmunoensayo y en el que el inmunoensayo es para la detección colorimétrica de un anticuerpo de un tipo en el que se adsorbe una cantidad de un analito en un soporte sólido en un recipiente de reacción; se forma un conjugado entre un reactivo inmunológico y una peroxidasa; se mezcla el conjugado con una muestra que va a someterse a prueba para detectar el anticuerpo, el anticuerpo se une al analito y al conjugado para formar un complejo inmunológico en fase sólida; y se determina la cantidad del anticuerpo midiendo la reacción del complejo inmunológico con un sustrato cromogénico oxidable mediante peróxido y la peroxidasa, que comprende: (a) proporcionar una disolución líquida que comprende el sustrato cromogénico, peróxido, y un colorante indicador de pH , en la que el sustrato cromogénico es TMB u OPD y es oxidable a un primer color con una absorbancia a una primera longitud de onda cuando se forma una mezcla de reacción entre la disolución líquida y el complejo inmunológico y es oxidable adicionalmente del primer color a un segundo color con una absorbancia a una segunda longitud de onda cuando se añade una disolución de parada al recipiente de reacción y el colorante indicador de pH produce un tercer color que es detectable a simple vista y tiene una absorbancia a una tercera longitud de onda cuando se añade una disolución de parada al recipiente de reacción que contiene la disolución líquida; (b) mezclar la disolución líquida con el complejo inmunológico en el recipiente de reacción para formar una mezcla de reacción que oxida el sustrato cromogénico al primer color; (c) añadir la disolución de parada a la mezcla de reacción en el recipiente de reacción para producir el segundo y tercer colores; y, 22 ES 2 367 547 T3 (d) medir espectrográficamente las absorbancias a la primera, segunda y tercera longitudes de onda, en el que se detecta una reacción positiva mediante absorbancia a la segunda longitud de onda, reacciones que no tienen absorbancia a la primera o segunda longitud de onda, pero tienen absorbancia a la tercera longitud de onda se clasifican como negativas, y en el que todas las reacciones sin absorbancia a la tercera longitud de onda se clasifican como falsas negativas. 23 ES 2 367 547 T3 24