Un medio de cultivo para células epiteliales de mamífero que comprende:

(i) al menos un IGF seleccionado entre IGF-I e IGF-II en donde, cuando IGF-I está presente de manera diferente a una quimera sintética IGF-I/VN, el medio de cultivo comprende una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP) seleccionado entre IGFBP3 o IGFBP5; (ii) vitronectina (VN) o al menos un fragmento de unión al receptor de la integrina de la misma; (iii) una o más proteínas activas biológicas distintas que estimulan el crecimiento y/o la diferenciación celular; y (iv) una ausencia de suero o una cantidad de suero que en ausencia de IGF-I o IGF-II no soportaría el crecimiento de células epiteliales

Campo de la invención

Esta invención se refiere al cultivo de células. Más particularmente, esta invención se refiere a un medio, sistema y procedimiento para propagar células epiteliales de mamífero, preferiblemente queratinocitos para uso posterior en el crecimiento y la regeneración de la piel. También se dan a conocer composiciones para uso en el crecimiento y la regeneración de la piel.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento tipo insulina (IGF), IGF-I e IGF-II, son factores de crecimiento peptídicos mitogénicos implicados en una amplia gama de procesos celulares entre los que se incluyen la hiperplasia, síntesis de ADN, diferenciación, progresión del ciclo celular e inhibición de la apoptosis (Keiss y col., 1994, Hormone Research 41 66; Wood & Yee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1; Jones y Clemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3). Estos efectos están mediados por enlace a su receptor de la superficie celular vinculado a la tirosina quinasa, el receptor de tipo IGF 1 (IGF-IR). Los IGF están también estrechamente regulados por una familia de proteínas de unión específicas, denominadas IGFBP, cuyo papel primario es unir los IGF libres y de este modo moderar sus semivida, especificidad y actividad (Clemmons, 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140 19).

Recientemente, se ha demostrado que la vitronectina (VN) se une directamente a IGF-II (Upton y col., 1999. Endocrinology 140 2928-31) mientras que IGF-I se puede unir a la VN en presencia de determinadas IGFBP (Publicación Internacional WO 02/24219; Kricker y col., 2003, Endocrinol. 144 2807-15). El hallazgo de que VN, una molécula de adhesión y organización de la matriz extracelular (ECM), se une a IGF-II con una afinidad que es similar a la que presenta IGF-II por IGF-IR (Upton y col., 1999, más arriba), su receptor biológicamente relevante, revela un vínculo físico específico entre la acción del IGF y la VN en la ECM. Adicionalmente, el IGF-II unido a la VN, y el IGF-I unido a la VN mediante las IGFBP, puede estimular respuestas funcionales sinérgicas in vitro en una amplia gama de células entre las que se incluyen queratinocitos humanos (Publicación Internacional WO 02/24219; Noble y col., 2003, más arriba), Kricker y col., 2003, más arriba).

Las heridas, quemaduras y úlceras son dolencias de la piel debilitantes y dolorosas que requieren tratamientos intensivos y costosos que, en muchos casos, solo tienen éxito en parte. Por ejemplo, más de 520.000 australianos actualmente se han diagnosticado de diabetes, y de estos, más del 5% experimentarán úlceras en los pies. Estas heridas afectan significativamente la calidad de vida del paciente, llevando a menudo a una hospitalización prolongada, y al final pueden conducir a una amputación. De hecho, la amplia mayoría de las amputaciones de las extremidades inferiores realizadas se deben a una úlcera que no cicatriza.

Un enfoque cada vez más seguido para cicatrizar heridas, quemaduras y úlceras es sustituir la piel muerta o dañada por queratinocitos autólogos o alogénicos que han crecido in vitro. Típicamente, los queratinocitos se hacen crecer en medios definidos en presencia de factores exógenos como suero o extractos de pituitaria bobina, habitualmente con células alimentadoras que optimizan el crecimiento de los queratinocitos.

Resumen de la invención

Los sistemas de cultivo celular típicos de la técnica anterior son relativamente caros en virtud de la inclusión de los factores exógenos anteriormente mencionados. Además, los factores exógenos derivados de animales tales como suero o extractos de pituitaria bobina están relativamente mal definidos y pueden albergar agentes infecciones tales como los que causan la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD, por sus siglas en inglés), VIH y otras enfermedades.

Con este fin, los presentes inventores han descubierto que los complejos de proteína que comprenden IGF-II y VN o IGF-I e IGFBP y VN estimulan respuestas proliferativas significativas en cultivos celulares primarios ex vivo en ausencia de suero. Más particularmente se pueden utilizar complejos de proteínas que comprenden IGF-II y VN o IGF-I e IGFBP y VN para estimular el crecimiento de queratinocitos a objeto de sustitución de piel, cicatrización de quemaduras y heridas y otros tratamientos terapéuticos que necesiten el crecimiento de piel ex vivo.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona un medio de cultivo para células epiteliales de mamífero que comprende:

(i) al menos un IGF seleccionado entre IGF-I e IGF-II en donde, cuando IGF-I está presente de manera diferente a una quimera sintética IGFI/VN, el medio de cultivo comprende una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP) seleccionado entre IGFBP3 o IGFBP5;

(ii) vitronectina (VN) o al menos un fragmento de unión al receptor de la integrina del mismo;

(iii) una o más proteínas activas biológicas distintas que estimulan el crecimiento y/o la diferenciación celular; y

(iv) en ausencia de suero o de una cantidad de suero que en ausencia de IGF-I o IGF-II no soportaría el crecimiento de células epiteliales.

En una realización, el suero está presente hasta una concentración no superior al 1% (v/v).

En otra realización el suero está presente hasta una concentración no superior al 0,5% (v/v).

En otra realización adicional el suero está presente hasta una concentración no superior al 0,1% (v/v).

En otra realización adicional más, el suero está ausente.

Preferiblemente, el fragmento de VN no comprende un dominio de unión a heparina (HBD).

Preferiblemente, el fragmento de VN comprende una región polianiónica.

De forma adecuada, el receptor de la integrina es un receptor de la integrina αv.

En otras realizaciones, cuando el medio de cultivo de células epiteliales de mamífero comprende una o más proteínas activas biológicas distintas dichas proteínas son EGFEGF y/o bFGF.

En realizaciones particulares, las células epiteliales son queratinocitos o progenitores de queratinocitos o células de la córnea.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un sistema de cultivo de células epiteliales humanas que comprende un recipiente de cultivo y el medio de cultivo de células epiteliales de mamífero del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para cultivo de células epiteliales de mamífero que incluye la etapa de cultivar una o más células epiteliales de mamífero en el sistema de cultivo de células epiteliales de mamífero del segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso del medio de cultivo de células epiteliales de mamífero del primer aspecto.

En toda esta memoria descriptiva, a menos que se indique de otro modo, "comprende", "comprenden" y "que comprenden" se utiliza de forma inclusiva en lugar de exclusiva, de forma que un número entero o grupo de números enteros definidos pueden incluir uno o más de otros números enteros o grupos de número enteros no definidos.

Breve descripción de las figuras

Figura1. Crecimiento de queratinocitos en presencia de complejos de proteína aislados y células alimentadoras en ausencia de suero. El crecimiento promedio de queratinocitos recientemente aislados con VitroGro (células +3t3) respecto al método convencional en el que está presente tanto suero bovino como células +3t3. P0, P1 y P2 respecto al número de veces que las células se han recogido y vuelto a plaquear (P0 = rendimiento de las células inmediatamente tras aislado de una muestra de piel). Los datos se obtuvieron mediante tinción con MTT que se convirtió en un sustrato coloreado mediante las células en crecimiento. No se muestran las barras de error debido a la importante variación entre distintos donantes de tejido.

Figura 2. Morfología de queratinocitos tras crecimiento en presencia de complejos de proteína aislados y células alimentadoras en ausencia de suero. Las células se hicieron crecer durante 3 semanas en presencia de suero fetal bovino y células +3t3 de ratón (A) o que crecieron durante 3 semanas en presencia de VitroGro (B; vitronectina,

IGFBP5 y IGF-I) y células +3t3 de ratón3t3 en ausencia de suero. La barra de escala mide aproximadamente 200 micrómetros... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo para células epiteliales de mamífero que comprende:

(i) al menos un IGF seleccionado entre IGF-I e IGF-II en donde, cuando IGF-I está presente de manera diferente a una quimera sintética IGF-I/VN, el medio de cultivo comprende una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP) seleccionado entre IGFBP3 o IGFBP5;

(ii) vitronectina (VN) o al menos un fragmento de unión al receptor de la integrina de la misma;

(iii) una o más proteínas activas biológicas distintas que estimulan el crecimiento y/o la diferenciación celular; y

(iv) una ausencia de suero o una cantidad de suero que en ausencia de IGF-I o IGF-II no soportaría el crecimiento de células epiteliales.

2. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación 1, en el que el suero está presente hasta una concentración no superior al 1% (v/v).

3. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación 1, en el que el suero está presente hasta una concentración no superior al 0,5% (v/v).

4. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación 1, en el que el suero está presente hasta una concentración no superior al 0,1% (v/v).

5. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación 1, en el que el suero está ausente.

6. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el fragmento de VN no comprende un dominio de unión a heparina (HBD).

7. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento de VN comprende una región polianiónica.

8. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el receptor de la integrina es un receptor de la integrina αv.

9. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el receptor de la integrina se selecciona entre una αvβ3 integrina o una αvβ5 integrina.

10. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende IGF-I, una IGFBP-3 o IGFBP-5 y VN en la forma de un complejo de proteína aislado y/o que comprende IGF-II y VN en forma de un complejo de proteína aislado.

11. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación 1, en el que dicho IGF y dicha VN o dicho fragmento de la misma están presentes en forma de un complejo de proteína aislado que es una proteína quimérica sintética.

12. El medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha una o más proteínas activas biológicas adicionales son EGFEGF y/o bFGF.

13. Uso del medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para cultivar células epiteliales.

14. Un sistema de cultivo de células epiteliales humanas que comprende un recipiente de cultivo y el medio de cultivo de células epiteliales de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. El sistema de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación 14, que comprende VN y/o fibronectina, o un fragmento de las mismas, inmovilizadas, unidas o asociadas de cualquier otra forma con el recipiente de cultivo.

16. Un procedimiento para cultivo de células epiteliales de mamífero que incluye la etapa de cultivar una o más células epiteliales de mamífero en el sistema de cultivo de células epiteliales de mamífero de la reivindicación

14 o la reivindicación 15.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que las células alimentadoras están ausentes durante al menos parte de la duración del cultivo.

18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la una o más células epiteliales de mamífero son queratinocitos o progenitores de queratinocitos.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que una o más células son células del epitelio córneo.