SIEMBRA DE CÉLULAS SOBRE SOPORTES POROSOS.

La presente invención se refiere a un procedimiento para sembrar células en un soporte. Antecedentes de la invención El transplante de tejido en un animal, tal como, por ejemplo, células madre, células cultivadas in vitro, o células primarias aisladas, típicamente implica la introducción directa de material celular en el receptor, ya sea en el torrente sanguíneo o directamente en un tejido. Sin embargo, estos procedimientos están asociados con complicaciones significativas, tales como la trombosis, que reduce la supervivencia celular. La ingeniería de tejidos puede proporcionar una solución a este problema proporcionando un soporte tridimensional que actúa como sustrato para la adhesión celular. Se ha demostrado previamente que células sembradas en un soporte diseñado apropiadamente podrían recrear el microentorno in vivo, facilitando de este modo las interacciones célula-célula y la expresión de funciones diferenciadas. Para construir dichas estructuras complejas, la eficacia del procedimiento de siembra de células puede ser importante para el rendimiento global de la construcción de tejido diseñada. Antes de la presente invención, la siembra de células en soportes ha implicado el simple depósito de células en el soporte dependiendo de la difusión pasiva de las células en el soporte. Estos enfoques no fueron muy satisfactorios (Vacanti y col., "Selective cell transplantation using bioabsorbable artificial polymers as matrices", J. Pediatr. Surg. 23(1 Pt 2): 3-9, 1988). Se han desarrollado varios enfoques diferentes para potenciar la eficacia de la siembra de células. Por ejemplo, se han usado matraces en agitación en la siembra de condrocitos en soportes de ácido poliglicólico (Vunjak-Novakovic y col., "Dynamic cell seeding of polymer supports for cartilage tissue engineering", Biotechnol. Prog. 14(2):193-202, 1998). El procedimiento implicaba suspender los soportes mediante agujas en una suspensión celular y mezclar con una barra de agitación magnética a 50 rpm. El procedimiento requería un largo tiempo para completarse, variando de varias horas a un día. Otro enfoque para la siembra de células es el uso de centrifugación, que produce un estrés mínimo en las células sembradas y potencia la eficacia de siembra. Se desarrolló un procedimiento de siembra de células por Yang y col. (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86, 2001), mencionado como Inmovilización Celular por Centrifugación (ICC). Se sembraron hepatocitos en cubos de poli(vinil formal) poroso hidrófilo. Tanto los cubos como los hepatocitos se suspendieron en medio en un tubo de centrifugación y se expusieron a etapas alternas de centrifugación y resuspensión. El procedimiento produjo una eficacia de siembra del 40% y requirió una gran cantidad de hepatocitos (2-8 x 10 7 células). Dar y col. (Biotechnol. Bioeng. 80(3): 305-12, 2002) utilizaron un enfoque más controlado en la siembra de células mediante centrifugación. Se sembraron cardiomiocitos en un soporte de alginato hidrófilo colocando el soporte en un pocillo de una placa de 96 pocillos y pipeteando 10 µl de suspensión celular en el mismo. La placa después se colocó en un rotor tipo portaplacas y se centrifugó durante 6 minutos a 1000 x g, 4ºC. Se informó de una eficacia de siembra del 80-90% en un soporte de alginato, que disminuyó al 60% cuando se usaron densidades de siembra mayores por soporte. Los procedimientos de centrifugación descritos anteriormente han tenido algún éxito pero tienen limitaciones. Una cuestión vital en el procedimiento es la porosidad del soporte. La fuerza centrífuga presiona la suspensión celular a través del soporte donde el material celular queda atrapado dentro de los poros del soporte. Si la porosidad es demasiado grande, el material celular pasa todo a través del soporte hasta la parte inferior de la cámara de centrifugación conduciendo a una bajada en la eficacia de siembra. Por otro lado, la disminución de la porosidad del soporte para tener en cuenta esta cuestión puede tener un efecto negativo sobre la supervivencia del material celular sembrado. Una alta porosidad es esencial para permitir la difusión de oxígeno y nutrientes. La siembra de células en un soporte hidrófobo es habitualmente más complejo que en uno hidrófilo. Las células habitualmente se suspenden en una solución de medio de cultivo en la que el agua es el componente principal. Un soporte hidrófobo repele una suspensión celular evitando que las células se infiltren en dicho soporte. Para superar dicha barrera, se requiere una fuerza accionadora. La fuerza, independientemente de su fuente, expone las células a un componente de estrés que es dañino para las células. Por tanto, sigue existiendo una necesidad para desarrollar un procedimiento simple y reproducible para sembrar células en soportes porosos, particularmente los hidrófobos, con elevada eficacia de siembra y poca o ninguna pérdida en la viabilidad celular. Sumario ES 2 367 655 T3 La presente invención proporciona un procedimiento para sembrar células de cualquier tipo en un soporte. El procedimiento de la presente invención puede diseñarse para no exponer las células sembradas a ninguna fuerza que pueda afectar a la viabilidad o función celular. El procedimiento puede no ejercer fuerzas dañinas sobre las células para guiar uniformemente la siembra de las células en el soporte, consiguiendo una elevada eficacia de siembra y ninguna pérdida significativa en la viabilidad celular. El procedimiento de la presente invención también puede ser más eficaz para reducir las cuestiones de contaminación. El uso de una fuerza para facilitar la siembra de 2 las células en un soporte puede implicar el procesamiento adicional de las células, que a su vez aumenta las oportunidades de contaminación. La presente descripción también describe un kit para sembrar células en un soporte biocompatible. Breve descripción de las figuras Figura 1: Micrografía electrónica de un soporte no tejido de la presente invención. La matriz del soporte está compuesta por fibras hechas de vicryl®. Figura 2: Micrografía electrónica de un soporte compuesto de la presente invención. La matriz del soporte está compuesta por fibras hechas de vicryl®. Se incorpora un componente de espuma en el componente fibroso. Figura 3: Una imagen de microscopía confocal de células madre mesenquimáticas en un soporte no tejido. Las células se tiñeron con un colorante vital, donde las células vivas se tiñen de verde y las células muertas se tiñen de rojo. Descripción detallada El término "soporte", como se usa en este documento, se refiere a una arquitectura tridimensional que es capaz de soportar células sobre la superficie o dentro de la arquitectura. El término "poroso", como se usa en este documento, se refiera a una pluralidad de aberturas en el soporte que pueden conducir o no a la interconexión de los espacios intersticiales dentro del soporte, que posibilita la distribución uniforme de nutrientes y células dentro del soporte. El término "biocompatible" se refiere a la capacidad del soporte de residir dentro de un mamífero de modo que no induzca efectos tóxicos o indeseables en ese mamífero. Por "biodegradable" o "absorbible" se entiende que el dispositivo puede degradarse o absorberse gradualmente por procesos biológicos naturales después de que el dispositivo se haya suministrado en un sitio de interés dentro de un mamífero. El término "matriz", como se usa en este documento, se refiere al material que comprende el componente sólido de un soporte. El término "soporte hidrófobo", como se usa en este documento, se refiere a un soporte compuesto por un polímero que no se humedece fácilmente cuando está en contacto con agua. Por ejemplo, uno con un ángulo de contacto con el agua por encima de 10º, más específicamente uno con un ángulo de contacto por encima de 45º, se consideraría hidrófobo. El término "soporte hidrófilo", como se usa en este documento, se refiere a un soporte compuesto por un polímero que se humedece fácilmente cuando está en contacto con agua. Por ejemplo, uno con un ángulo de contacto con el agua por debajo de 45º, y más específicamente uno con un ángulo de contacto por debajo de 10º, se consideraría hidrófilo. El procedimiento de siembra de la presente invención puede aplicarse a cualquier tipo celular. El término "células", como se usa en este documento, se refiere a células aisladas, líneas celulares (incluyendo células diseñadas in vitro), cualquier preparación de tejido vivo, incluyendo explantes de tejido primario y preparaciones de los mismos. El término "medio", como se usa en este documento, se refiere a un líquido que se usa para hidratar los soportes de la presente invención. El medio es no tóxico para las células y es compatible con el líquido que se usa para introducir el material celular... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para sembrar una pluralidad de células en un soporte poroso que comprende las etapas de: (a) introducir un líquido en el soporte, y ES 2 367 655 T3 (b) retirar parcialmente el líquido del soporte por la aplicación de una fuerza centrífuga, una fuerza 5 compresiva o un vacío, creando de este modo huecos en el soporte, y (c) poner en contacto el soporte de la etapa (b) con una pluralidad de células, y (d) permitir que las células entren en el soporte sin exposición a una fuerza externa que pueda afectar a la viabilidad celular. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el líquido es medio. 10 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de células es una suspensión. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la suspensión contiene medio. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los poros son entre aproximadamente 50 y 1000 µm. 6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte es hidrófobo. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células se reconstituyen en un volumen de líquido que es 15 menor o igual al volumen de líquido que se retira. 8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de células se selecciona entre el grupo que consiste en células madre, células precursoras/progenitoras pancreáticas, células productoras de insulina modificadas por ingeniería genética, islotes pancreáticos primarios, hepatocitos, células cromafines, células precursoras neurales, células progenitoras, células precursoras, células de médula ósea, células sanguíneas de 20 cordón umbilical, angioblastos, células endoteliales, osteoblastos, células de músculo liso, células renales, fibroblastos, miofobroblastos, células cardiovasculares, células neurales, células precursoras neurales, células amnióticas y células placentarias post-parto. 7 ES 2 367 655 T3 8 ES 2 367 655 T3 9 ES 2 367 655 T3