MATRICES DE PROTEÍNA DEL PLASMA Y MÉTODOS PARA SU PREPARACIÓN.

Una matriz porosa biocompatible liofilizada que comprende proteínas del plasma,

las proteínas del plasma que comprenden fibrina, y al menos un agente anti fibrinolítico, que además comprende ácido hialurónico y polietileno glicol como componentes auxiliares, con poros uniformes en un rango de tamaño de 50-300 micrones, carente de agentes quelantes orgánicos y que tiene una humedad residual por debajo del 3%, útil como un armazón para el crecimiento de células

Campo de la invención

La presente invención se refiere a biomatrices, que comprenden proteínas del plasma liofilizadas útiles para aplicaciones clínicas incluyendo, como implantes para la ingeniería de tejidos, así como, en biotecnología. Las 5 matrices de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar clínicamente, per se o como implantes portadores de células.

Antecedentes de la invención

La ingeniería de tejidos se puede definir como el oficio de reconstrucción de tejidos de mamíferos, tanto estructural como funcionalmente (Hunziker, 2002). La ingeniería de tejidos in vitro, generalmente incluye la entrega de un 10 armazón polimérico que sirve como un soporte de arquitectura en el que las células se pueden sujetar, proliferar, y sintetizar nuevo tejido para reparar una herida o defecto.

Un ejemplo de un tejido, que es propenso al daño por enfermedad y trauma es el cartílago articular, uno de varios tipos de cartílago en el cuerpo, que se encuentra en la superficie articular de los huesos. El daño al cartílago puede resultar de una enfermedad inflamatoria tal como artritis reumatoide, a partir de un proceso degenerativo tal como 15 osteoartritis o de trauma tal como fractura intraarticular o después de las lesiones de ligamento. Las lesiones de cartílago por lo general se asocian con el dolor y la función reducida y generalmente no se curan sin intervención médica.

Las estrategias terapéuticas actuales, para reparar el cartílago dañado incluyen procedimientos que inducen una respuesta de reparación espontánea y aquellas que reconstruyen el tejido de una manera estructural y funcional. El 20 anterior, incluyendo técnicas quirúrgicas tales como artroplastía de abrasión, microfactura o perforación micro subcondrial, exponer la región subcondral del hueso permitiendo así la formación de un coagulo de sangre y la infiltración de células madre pluripotentes para iniciar la respuesta de cicatrización. Por lo general, el tejido inducido no es durable y las mejoras clínicas son de corta duración.

Una alternativa es el trasplante de tejido condral u osteocondral de, ya sea, fuentes autólogas o alogénicas. La base 25 detrás del trasplante, radica en la noción que las actividades proliferativas y de diferenciación del tejido de estas células debería dar lugar a la formación de neocartílago. De hecho, esta técnica muestra alta variabilidad y limitado éxito clínico.

Las matrices útiles para la regeneración del tejido y/o como superficies compatibles útiles para el cultivo de tejido son bien conocidas en el oficio. Estas matrices, por consiguiente, se pueden considerar como sustratos para 30 crecimiento celular ya sea in vitro o in vivo. Las matrices apropiadas para el crecimiento y/o regeneración del tejido incluyen tanto entidades biodegradables como bioestables. Entre los muchos candidatos que pueden servir como matrices útiles reivindicadas para apoyar el crecimiento o la regeneración de los tejidos, se incluyen geles, espumas, láminas, y numerosas estructuras de partículas porosas de estados y formas diferentes.

Los materiales porosos formados de materiales biodegradables que ocurren naturalmente o sintéticamente han sido 35 utilizados en el pasado como apósitos de herida o implantes. El material poroso proporciona soporte estructural y un armazón para tejido en crecimiento, mientras que la cicatrización progresa. Preferiblemente, el material poroso gradualmente se absorbe como el tejido al rededor de la herida regenera. Las materiales bioabsorbibles típicos para utilizar en la fabricación de implantes o apósitos para heridas porosos incluyen, tanto polímeros sintéticos y biopolímeros tales como proteínas estructurales y polisacáridos. Los biopolímeros pueden ser, tanto seleccionados 40 como manipulados de forma que afectan sus propiedades físico-químicas. Por ejemplo, los biopolímeros pueden ser ligados en cruz ya sea enzimática, químicamente o por otros medios, proporcionando así mayor o menor grado de flexibilidad o susceptibilidad a la degradación.

Entre los múltiples polímeros naturales que se han revelado por ser útiles para la ingeniería o cultivo de tejidos, se pueden enumerar varios constituyentes de la matriz extracelular incluyendo fibronectina, varios tipos de colágeno, y 45 laminina, así como queratina; fibrina y fibrinógeno; ácido hialurónico, heparán sulfato, sulfato de condroitina y otros.

La fibrina es una principal proteína del plasma, que participa en el proceso de coagulación sanguínea. La coagulación de la sangre es un proceso complejo incluyendo la interacción secuencial de un número de proteínas del plasma, en particular de fibrinógeno (factor I), factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII y factor XIII. Otras proteínas del plasma tales como factor Von Willebrand (vWF), albúmina, 50 inmunoglobulina, factores de coagulación, y los componentes complemento también pueden jugar un papel en la formación de redes de proteínas o coágulos en la sangre.

La fibrina se conoce en el oficio como un dispositivo médico adhesivo al tejido y puede ser utilizado en la curación de heridas y reparación de tejidos. El concentrado de proteína derivado del plasma liofilizado (que contiene Factor XIII, fibronectina, y fibrinógeno), en la presencia de trombina y calcio forma una goma biológica inyectable. US Patent No. 5,411,885 revela un método de inclusión y cultivo de tejido que emplea la goma de fibrina. US Patent No. 4,642,120 revela el uso de goma de fibrinógeno en combinación con células condrocíticas o mesenquimales autólogas para 5 promover la reparación del cartílago y los defectos del hueso. US Patent No. 5,260,420, revela un método para la preparación y uso de goma biológica que comprende fibrina para la inyección en el sito de lesión. US Patent No. 6,074,663 revela un material similar a una lámina de fibrina entrecruzada para la prevención de formación de adhesión.

US Patent No. 6,310,267 revela un proceso de preparación específico de una red de fibrina flexible biodegradable 10 para la cicatrización de una herida. El proceso requiere de la dialización de una solución de fibrinógeno con una solución que contiene quelantes y que forman la red flexible por la adición de una solución de trombina, la liofilización y la liofilización de la red.

US Patent No. 5,972,385 revela una matriz de polisacárido de colágeno reticulado que se administra solo o en combinación con otros terapéuticos, tales como factores de crecimiento, para reparación de tejido. La invención 15 también revela la matriz de polisacárido de colágeno reticulado en combinación con la fibrina. Las etapas de preparación de la matriz incluyen congelación y liofilización así como la adición de fibrinógeno y trombina para formar la fibrina en dicha matriz.

Una red de fibrina liofilizada para la cicatrización de una herida se ha revelado en US Patent No. 6,310,267. La preparación de la red, según se revela, requiere una diálisis de una o varias etapas de la solución de fibrinógeno. De 20 acuerdo con esta divulgación, la diálisis de una o varias etapas de la solución de fibrinógeno fundamentalmente cambia su composición y la concentración de sales y aminoácidos habitualmente contenidos en esta, se reduce considerablemente. La diálisis se lleva a cabo en una solución acuosa de una sal inorgánica fisiológicamente compatible tal como NaCl y un agente complejante orgánico tal como sales de metal alcalino de EDTA, de ácido oxálico o de ácido cítrico. 25

Una esponja de fibrina que contiene un activador de coagulación de la sangre para hemostasis, adhesión de tejido, cicatrización de la herida y soporte de cultivo celular se revela en WO 99/15209.

De acuerdo con esta divulgación, la restauración de humedad o contenido de agua después de la liofilización es crucial para obtener una esponja suave, adaptable, altamente absorbente.

US Patent Nos. 5,955,438 y 4,971,954 revela matrices basadas en colágeno reticulado por azúcares, útiles para la 30 regeneración del tejido. US Patent No.5,700,476 proporciona un material de implante bioabsorbible que contiene agentes farmacológicamente activos, apropiados para utilizar en la reparación de heridas. El método describe la mezcla de dos componentes biopolímeros, la liofilización para formar una esponja heteromórfica, que permite una liberación gradual de un agente activo farmacológicamente.

US Patent No. 5,736,372 revela... [Seguir leyendo]

1. Una matriz porosa biocompatible liofilizada que comprende proteínas del plasma, las proteínas del plasma que comprenden fibrina, y al menos un agente anti fibrinolítico, que además comprende ácido hialurónico y polietileno glicol como componentes auxiliares, con poros uniformes en un rango de tamaño de 50-300 micrones, carente de agentes quelantes orgánicos y que tiene una humedad residual por debajo del 3%, útil como un armazón para el 5 crecimiento de células.

2. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las proteínas del plasma se mezclan con al menos 0.5 unidades de trombina por mg de proteína.

3. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos una de las proteínas del plasma es autóloga.

4. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde todas las proteínas del plasma son autólogas. 10

5. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente anti-fibrinolítico es el ácido tranexámico.

6. La matriz de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende al menos 5% de ácido tranexámico.

7. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células son células madre o células progenitoras.

8. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células se seleccionan de tipos de células como condrocitos, osteocitos, hepatocitos, mesenquimales, epiteliales, uroteliales, neuronales, pancreáticas, renales u 15 oculares.

9. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células son condrocitos.

10. La matriz de acuerdo con las reivindicaciones 8, 9 o 1, en donde las células logran una densidad de al menos 104 células por cm3.

11. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende al menos un agente bioactivo, 20 seleccionado de factores de crecimiento, citoquinas, enzimas, agentes anti microbianos, anti inflamatorios.

12. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tamaño de poro preferiblemente oscila entre 100-200 micrones.

13. Un método de preparación de una matriz porosa de proteínas del plasma, útil como un armazón para el crecimiento de las células in vitro, el método que comprende las etapas de: 25

mezcla de las proteínas del plasma con la trombina en la presencia de iones de calcio y al menos un agente anti-fibrinolítico bajo condiciones apropiadas para la coagulación, en la ausencia de agentes quelantes orgánicos, y además la adición del ácido hialurónico y del polietileno glicol como componentes auxiliares;

moldear la mezcla de proteínas del plasma y de trombina en un soporte sólido antes del moldeado;

congelación de la mezcla coagulada; y 30

liofilización de la mezcla coagulada, para obtener una esponja de acuerdo con la reivindicación 1.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende después de la etapa de liofilización de la mezcla coagulada las etapas adicionales de:

corte de la esponja en secciones de la forma deseada;

siembra de las secciones con las células; y 35

cultivo de las células en dichas secciones hasta que las células alcancen una densidad de al menos 104 células por cm3;

en donde mediante la liofilización de la mezcla coagulada, se obtiene una esponja.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende las etapas adicionales de:

opcionalmente el lavado de la esponja, eliminando así, los componentes auxiliares solubles; opcionalmente volver a liofilizar la matriz, obteniendo así una esponja que no tenga más de 3% de humedad residual; y

corte de la esponja en la forma deseada.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde las proteínas del plasma comprenden al menos fibrinógeno y factor XIII. 5

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde al menos una de las proteínas del plasma es autóloga.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde todas las proteínas del plasma son autólogas.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde las proteínas del plasma se 10 mezclan con al menos 0.5 unidades de trombina por mg de proteína.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde el agente anti-fibrinolítico es el ácido tranexámico.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende al menos 5% del ácido tranexámico.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las células se seleccionan de tipos de células como 15 condrocitos, hepatocitos, osteocitos, mesenquimales, epiteliales, uroteliales, neuronal, pancreáticas, renales u oculares.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las células son condrocitos.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 15, que además comprende la siembra de las secciones con las células y el cultivo de las células en dichas secciones, hasta que las células alcancen una densidad de al menos 104 20 células por cm3.

25. Un implante o una cubierta porosa para un implante preparado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15.

26. Uso de una matriz porosa biocompatible liofilizada de acuerdo con las reivindicaciones 1-12, para la preparación de un implante para tratar un tejido lesionado. 25

27. Uso de un implante de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el tejido es tejido esquelético, preferiblemente cartílago.

28. Un kit que comprende la matriz porosa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una matriz preparada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 y las instrucciones para su uso.