SEPARACIÓN DE LA GLP-1 Y DE PÉPTIDOS ASOCIADOS POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.

Separación de GLP-1 y de péptidos asociados por cromatografía de intercambio iónico Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a un proceso de cromatografía de intercambio iónico para purificar GLP-1 o un análogo o un derivado de una mezcla conteniendo dicho GLP-1 e impurezas relacionadas, y a un método industrial que incluye tal proceso de cromatografía de intercambio iónico. Antecedentes [0002] Para la purificación y análisis de proteínas y péptidos, la cromatografía es un método bien conocido y muy usado. Varios principios cromatográficos diferentes son aplicados, entre esta cromatografía de intercambio iónico (IEC). El principio de IEC incluye dos métodos diferentes: intercambio aniónico e intercambio catiónico según la carga de los ligandos en la resina de intercambio iónico. Un proceso de purificación convencional IEC normalmente consiste en una o más: secciones de equilibrado, secciones de aplicación o de carga, secciones de lavado, secciones de elución, y secciones de regeneración (cf. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, or Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª Edición (1995)). [0003] El principio principal de elución en IEC en procesos de purificación industriales es gradientes de componente de sal en una solución tamponada acuosa a pH constante, bien como gradientes de paso o lineales (cf. S. Bjørn y L. Thim, Activation of Coagulation Factor VII to VIIa, Res. Discl. N°. 269, 564-565, 1986). La elución isocrática es posible, pero raramente usada. Solventes orgánicos o modificadores han sido ocasionalmente añadidos a las soluciones para tener la proteína o péptido en la forma deseada o sólo en solución (cf. K. H. Jørgensen, Process for Purifying Insulin, US Patent No. 3,907,676, Sept. 23, 1975; y J. Brange, O. Hallund y E. Sørensen, Chemical Stability of Insulin 5. Isolation, Characterisation and Identification of Insulin Transformation Products, Acta Pharm. Nord. 4(4), 223-232, 1992). [0004] Péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) (cf. Schmidt et al. en Diabetologia 28 704-707, 1985) y análogos al igual que derivados de las mismas se pueden utilizar en el tratamiento de diabetes, como se describe en WO 98/08871. Un péptido GLP-1 y análogos relacionados son fácilmente disueltos en solventes acuosos y mantenidos en una forma monomizada. La purificación por IEC tradicional de GLP-1 con gradientes de sal en solventes acuosos puede, no obstante, ser problemática debido a la falta de selectividad entre una fracción de objetivo de GLP-1 e impurezas relacionadas. [0005] WO 87/06941 (The General Hospital Corporation) revela fragmentos peptídicos que comprenden GLP-1 (7-37) y derivados funcionales de los mismos y su uso como un agente insulinotrópico. [0006] WO 90/11296 (The General Hospital Corporation) revela fragmentos peptídicos que comprenden GLP-1 (7-36) y derivados funcionales de los mismos y tiene una actividad insulinotrópica que excede la actividad insulinotrópica de GLP-1 (1-36) o GLP-1 (1-37) y su uso como agentes insulinotrópicos. [0007] WO 91/11457 (Buckley et al.) divulga análogos de los péptidos activos GLP-1 7-34, 7-35, 7-36, y 7-37. [0008] WO 98/08871 divulga derivados de GLP-1 en los que un sustituyente lipofílico se fija al menos a un residuo de aminoácido. Los sustituyentes lipofílicos están en grupos de cadena larga particulares conteniendo por ejemplo 12-24 átomos de carbono. [0009] WO 98/08872 divulga derivados de GLP-2 en los que un sustituyente lipofílico se fija al menos a un residuo de aminoácido. Los sustituyentes lipofílicos están en grupos de cadena larga particulares conteniendo por ejemplo 12-24 átomos de carbono. [0010] WO 96/32414 divulga análogos de GLP-2. ES 2 366 199 T3 [0011] EP 0699686-A2 (Eli Lilly & Co.) divulga fragmentos truncados N-terminales determinados de GLP-1 que se proporcionan por ser biológicamente activos. [0012] EP 0708179-A2 (Eli Lilly & Co.) divulga análogos de GLP-1 y derivados que incluyen un grupo de imidazol N-terminal y opcionalmente un grupo acilo de cadena recta C6-C10 fijado al residuo de lisina en la posición 34. 2 [0013] EP 0207727-A2 se refiere a un proceso para recuperar glucagón de glándulas del páncreas. [0014] J.Chromatography 237, 417-28, 1982 describe la separación de péptidos por HPLC en una fase enlazada de intercambio aniónico débil. [0015] En US 3907676 un proceso para reducir la antigenicidad de insulina es descrito donde se usa un sistema de cromatografía de intercambio aniónico. [0016] US 5101013 se refiere a un proceso para el aislamiento de proteínas básicas tales como insulinas de una mezcla de proteínas donde se usa un intercambiador catiónico fuertemente ácido [0017] US 4361 51 0 concierne métodos para producir complejos de coagulación sanguínea que comprenden factores de coagulación II, VII, IX y X, donde los métodos incluyen fases de lavado de intercambio aniónico y de elución. Descripción de la invención ES 2 366 199 T3 [0018] A diferencia de las técnicas descritas anteriormente IEC para purificación de cualquier proteína o péptido, que consiste en una o más fases de equilibrado, fases de aplicación o de carga, fases de lavado, fases de elución, y fases de regeneración, la presente invención se refiere al uso de un modificador orgánico para la purificación de un péptido GLP-1 y todos los análogos relacionados etc. por IEC. Por adición de un modificador orgánico especialmente a la sección de elución de la fase de purificación IEC, un aumento en selectividad y eficiencia se obtiene en comparación con la misma ejecución con tampones acuosos, tanto para cromatografía de intercambio aniónico como catiónico. La solución de equilibrado y la muestra para aplicación puede o no contener el modificador orgánico. El uso de un modificador orgánico tiene la ventaja adicional que no se necesita ninguna sal o se necesitan concentraciones muy bajas de sal para elución, especialmente para cromatografía de intercambio catiónico en comparación con un sistema cromatográfico acuoso. [0019] En un aspecto amplio la presente invención se refiere a un proceso de cromatografía de intercambio catiónico para depuración de un péptido de una mezcla que comprende dicho péptido e impurezas relacionadas, comprendiendo la fase de: separar dicho péptido y dichas impurezas relacionadas de dicha mezcla por elución en una solución que comprende un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón, con un gradiente lineal o escalonado o isocráticamente en componente de sal y/o con un gradiente de pH lineal o escalonado o a un valor de pH constante, donde el gradiente de pH o valor de pH debería estar en el intervalo donde dicho péptido tiene una red de carga global o local positiva diferente de la red de carga local o global positiva de dichas impurezas relacionadas para eliminar dichas impurezas relacionadas. [0020] En otro aspecto amplio la presente invención se refiere a un proceso de cromatografía de intercambio catiónico para la depuración de un péptido de una mezcla que comprende dicho péptido e impurezas relacionadas, comprendiendo la fase de: separar dicho péptido y dichas impurezas relacionadas de dicha mezcla por elución en una solución que consiste esencialmente en un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón, con un gradiente lineal o escalonado o isocráticamente en componente de sal y/o con un gradiente de pH lineal o escalonado o a un valor de pH constante, donde el gradiente de pH o valor de pH deberían estar en el intervalo donde dicho péptido tiene una red de carga global o local positiva diferente de la red de carga local o global positiva de dichas impurezas relacionadas para eliminar dichas impurezas relacionadas. [0021] En otro aspecto amplio la presente invención se refiere a un proceso de cromatografía de intercambio aniónico para depuración de un péptido de una mezcla que comprende dicho péptido e impurezas relacionadas, comprendiendo la fase de: separar dicho péptido y dichas impurezas relacionadas de dicha mezcla por elución en una solución que comprende un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón, con un gradiente lineal o escalonado o isocráticamente en componente de sal y/o con un gradiente de pH lineal o escalonado o a un valor de pH constante, donde el gradiente de pH o valor de pH debería estar en el intervalo donde dicho péptido tiene una red de carga global o local negativa diferente de la red de carga local o global negativa de dichas impurezas relacionadas para eliminar dichas impurezas relacionadas. 3 ES 2 366 199 T3 [0022] En otro aspecto amplio la presente invención se refiere a un proceso de cromatografía de intercambio aniónico para purificar un péptido... 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1. Proceso de cromatografía de intercambio de cationes para la depuración de un péptido GLP-1 de una mezcla comprendiendo dicho péptido GLP-1 y las impurezas relacionadas, que comprende la etapa de: separar dicho péptido GLP-1 y dichas impurezas relacionadas de dicha mezcla por elución en una solución que consiste esencialmente en un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón, con un gradiente lineal o escalonado o isocráticamente en un componente de sal y/o con un gradiente del pH lineal o de escalonado o a un valor del pH constante, donde el gradiente del pH o del valor del pH debería estar en el rango donde dicho péptido GLP-1 tiene una carga neta global o positiva local diferente de la red local o global positiva de dichas impurezas relacionadas para eliminar dichas impurezas relacionadas; donde el modificador orgánico se selecciona de alcanol C1-6 y de glicol C2-6; y donde las impurezas relacionadas son impurezas que tienen una carga neta global o diferente local y son seleccionadas del grupo que consiste en formas truncadas, formas extendidas, formas con aminoácidos extra, derivados, ésteres, formas desamidadas, formas incorrectamente plegadas, formas con glicosilación indeseada y formas con sialilación. 2. Proceso de cromatografía de intercambio aniónico para la depuración de un péptido GLP-1 de una mezcla comprendiendo dicho péptido GLP-1 y las impurezas relacionadas, que comprende la etapa de: separar dicho péptido GLP-1 y dichas impurezas relacionadas de dicha mezcla por elución en una solución que consiste esencialmente en un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón, con un gradiente lineal o escalonado o isocráticamente en un componente de sal y/o con un gradiente de pH lineal o escalonado o a un valor de pH constante, donde el gradiente de pH o el valor de pH debería estar en el rango donde dicho péptido GLP-1 tiene una carga neta global o negativa local diferente de la carga neta local o global negativa de dichas impurezas relacionadas para eliminar dichas impurezas relacionadas; donde el modificador orgánico se selecciona de alcanol C1-6 y glicol C2-6; y donde las impurezas relacionadas son impurezas que tienen una carga neta global o diferente local y son seleccionadas del grupo que consiste en formas truncadas, formas extendidas, formas con aminoácidos extra, derivados, ésteres, formas desamidadas, formas incorrectamente plegadas, formas con glicosilación indeseada y formas con sialilación. 3. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicho péptido GLP-1 a purificar se selecciona de GLP-1 (7­ 37), GLP-1 (7-36) amida, Arg34GLP-1 (7-37); Arg26GLP-1 (7-37); Arg34Lys26(N-(-Glu-(N-tetradecanoil)))GLP-1 (7-37); Arg34Lys26(N-(-Glu-(N-hexadecanoil)))GLP-1 (7-37); Arg26Lys34(N-(-Glu-(N-tetradecanoil)))GLP-1 (7-37); Arg26Lys34(N-(-Glu-(N-hexadecanoil)))GLP-1 (7-37); Val8GLP-1(7-37); Thr8GLP-1(7-37); Met8GLP-1 (7-37); Gly8GLP-1 (7-37); Val8GLP-1 (7-36) amida; Thr8GLP-1 (7-36) amida; Met8GLP-1(7-36) amida; y Gly8GLP­ 1(7-36) amida 4. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 3, donde la proporción del modificador orgánico con agua en una base de porcentaje en peso es de 1:99 a 99:1. 5. Proceso según la reivindicación 4, donde la proporción del modificador orgánico con agua en una base de pocentaje en peso es de 30:70 a 70:30. 6. Proceso según la reivindicación 4, donde la proporción del modificador orgánico con agua en una base de porcentaje en peso es de 35:50 a 50:35. 7. Proceso según la reivindicación 4, donde la proporción del modificador orgánico con agua en una base de porcentaje en peso es de 40:50 a 50:40. 8. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 7, donde el modificador orgánico se selecciona de alcanol C1 -6 y glicol de hexileno. 9. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 8, donde el modificador orgánico es alcanol C1-6. 10. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 8, donde el modificador orgánico es glicol de hexileno. 38 ES 2 366 199 T3 39 ES 2 366 199 T3 ES 2 366 199 T3 41 ES 2 366 199 T3 42 ES 2 366 199 T3 43 ES 2 366 199 T3 44 ES 2 366 199 T3 ES 2 366 199 T3 46 ES 2 366 199 T3 47 ES 2 366 199 T3 48 ES 2 366 199 T3 49 ES 2 366 199 T3 ES 2 366 199 T3 51 ES 2 366 199 T3 52