SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS QUE CODIFICAN EL GEN METD.

Bacteria corineforme en la que se atenúa el gen metD, en la que el gen metD comprende un polinucleótido que a) es idéntico en un grado de al menos 70% a un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No.

2, o b) codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un grado de al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 2, y el polipéptido tiene actividad reguladora de la transcripción en la que la atenuación se logra - usando un promotor débil, - usando un alelo que codifica una proteína con baja actividad, o - inactivando el gen

Campo de la Invención

La invención proporciona secuencias nucleotídicas a partir de bacterias corineformes que codifican el gen metD, y un procedimiento para la preparación de aminoácidos usando bacterias en las que el gen metD está atenuado.

Técnica Anterior

Los L-aminoácidos, en particular la L-metionina, se usan en medicina humana y en la industria de fármacos, en la industria alimentaria, y muy particularmente en nutrición animal.

Se sabe que los aminoácidos se preparan mediante fermentación a partir de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, constantemente se está llevando a cabo un trabajo para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras al proceso se pueden referir a medidas de fermentación, tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tales como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento de la forma del producto mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades de producción intrínsecas del propio microorganismo.

Los métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes se usan para mejorar las propiedades de producción de estos microorganismos. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos, o son auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora, y que producen aminoácidos.

Los métodos de la técnica de ADN recombinante también se han empleado durante algunos años para mejorar la cepa de cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácido, amplificando genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigando el efecto sobre la producción de aminoácidos.

Objeto de la Invención

El objeto de la invención es proporcionar nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de aminoácidos.

Descripción de la Invención

Cuando se mencionan en lo siguiente L-aminoácidos o aminoácidos, esto significa uno o más aminoácidos, incluyendo sus sales, escogidos del grupo que consiste en L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, Ltriptófano y L-arginina. Se prefiere particularmente L-metionina.

Cuando se menciona en lo siguiente L-metionina o metionina, también se quiere decir por esto las sales, tales como por ejemplo hidrocloruro de metionina o sulfato de metionina.

La invención proporciona un polinucleótido aislado a partir de bacterias corineformes, que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el gen metD, escogido del grupo que consiste en

a) polinucleótido que es idéntico en un grado de al menos 70% a un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 2,

b) polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un grado de al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 2,

c) polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b),

d) polinucleótido que comprende al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia polinucleotídica de a), b)

o c),

teniendo preferiblemente el polipéptido la actividad del regulador de la transcripción MetD.

Los reguladores transcripcionales son proteínas que son capaces de incrementar o disminuir el nivel de transcripción de genes específicos uniéndose a ciertas regiones de ADN. Se ha encontrado que los reguladores tienen una estructura específica, denominada motivo hélice-giro-hélice. La invención proporciona la función del regulador transcripcional metD como la represión de genes que están implicados en la biosíntesis de L-aminoácidos, en particular la biosíntesis de L-metionina. La atenuación del regulador transcripcional metD mejora la producción de Lmetionina en bacterias corineformes.

La invención también proporciona el polinucleótido mencionado anteriormente, siendo éste preferiblemente un ADN que es capaz de replicarse, que comprende:

(i) la secuencia nucleotídica mostrada en SEC ID No. 1, o

(ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro de la degeneración del código genético, o

(iii) al menos una secuencia que se hibrida con las secuencias complementarias a las secuencias (i) o (ii), y opcionalmente

(iv) mutaciones sentido de función neutra en (i) que no modifican la actividad de la proteína/polipéptido.

Finalmente, la invención también proporciona nucleótidos escogidos del grupo que consiste en

a) polinucleótidos que comprenden al menos 15 nucleótidos sucesivos escogidos de la secuencia nucleotídica de SEC ID No. 1 entre las posiciones 1 y 313,

b) polinucleótidos que comprenden al menos 15 nucleótidos sucesivos escogidos de la secuencia nucleotídica de SEC ID No. 1 entre las posiciones 314 y 1024,

c) polinucleótidos que comprenden al menos 15 nucleótidos sucesivos escogidos de la secuencia nucleotídica de SEC ID No. 1 entre las posiciones 1025 y 1322.

La invención también proporciona:

un polinucleótido, en particular ADN, que es capaz de replicarse, y comprende la secuencia nucleotídica como se muestra en SEC ID No. 1;

un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID No. 2;

un vector que contiene partes del polinucleótido según la invención, pero al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia reivindicada,

y bacterias corineformes en las que el gen metD está atenuado, en particular mediante una inserción o supresión.

La invención también proporciona polinucleótidos, que comprenden sustancialmente una secuencia polinucleotídica, que son obtenibles mediante la identificación por medio de hibridación de una genoteca correspondiente de una bacteria corineforme, que comprende el gen completo o partes del mismo, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido según la invención de acuerdo con SEC ID No. 1 o un fragmento de la misma, y del aislamiento de la secuencia polinucleotídica mencionada.

Los polinucleótidos que comprenden las secuencias según la invención son adecuados como sondas de hibridación para ARN, ADNc y ADN, a fin de aislar, en la longitud completa, ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que codifican el regulador de la transcripción MetD, o para aislar aquellos ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que tienen una elevada similitud con la secuencia del gen metD. También son adecuados para la incorporación en denominados “chips”, “microchips” o “chips de ADN”, a fin de detectar y determinar los polinucleótidos correspondientes.

Los polinucleótidos que comprenden las secuencias según la invención son adecuados además como cebadores, con cuya ayuda se puede preparar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ADN de genes que codifican el regulador de la transcripción MetD.

Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores comprenden al menos 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, preferiblemente al menos 20, 21, 22, 23 ó 24, de forma muy particularmente preferible al menos 15, 16, 17, 18 ó 19 nucleótidos sucesivos. También son adecuados los oligonucleótidos con una longitud de al menos 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 o al menos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 nucleótidos. Opcionalmente, también son adecuados los oligonucleótidos con una longitud de al menos 100, 150, 200, 250 ó 300 nucleótidos.

“Aislado” significa separado de su entorno natural.

“Polinucleótido” se refiere en general a polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, siendo posible que estos sean ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado.

Los polinucleótidos según la invención incluyen un polinucleótido según SEC ID No. 1 o un fragmento preparado a partir del mismo, y también aquellos que son al menos 70% a 80%, preferiblemente al menos 81% a 85%, particularmente de forma preferible al menos 86% a 90%, y de forma muy particularmente preferible al menos 91%, 93%, 95%, 97%... [Seguir leyendo]

1. Bacteria corineforme en la que se atenúa el gen metD, en la que el gen metD comprende un polinucleótido que

a) es idéntico en un grado de al menos 70% a un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 2, o b) codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un grado de al

menos 70% a la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 2, y el polipéptido tiene actividad reguladora de la transcripción en la que la atenuación se logra

- usando un promotor débil,

- usando un alelo que codifica una proteína con baja actividad, o

- inactivando el gen.

2. Bacteria corineforme según la reivindicación 1, en la que se elimina el gen metD.

3. Bacteria corineforme según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el polinucleótido es un ADN que es capaz de una replicación, que comprende

(i) la secuencia nucleotídica mostrada en SEC ID No. 1, o

(ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro del intervalo de la degeneración del código genético, o

(iii) al menos una secuencia que se hibrida con la secuencia complementaria a las secuencia (i) o (ii) bajo una restricción que corresponde como máximo a 2x SSC, y opcionalmente

(iv) mutaciones sentido de función neutra en (i).

4. Bacteria corineforme según la reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No. 2.

5. Bacterias corineformes según las reivindicaciones 1 a 4, en las que dicha inactivación se logra mediante un vector que tiene al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia mostrada en SEC ID No. 1.

6. Bacterias corineformes según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en las que dichas bacterias son de la especie Corynebacterium glutamicum.

7. Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, en el que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) fermentar las bacterias corineformes según una de las reivindicaciones 1 a 6 que producen el L-aminoácido deseado; b) concentrar el L-aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y c) aislar el L-aminoácido.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el L-aminoácido es L-metionina.

9. Un procedimiento para la preparación de un aditivo para piensos para animales que contiene L-metionina a partir

de caldos de fermentación, que comprende las etapas a) cultivar y fermentar un microorganismo productor de L-metionina según las reivindicaciones 1 a 6 en un medio de fermentación;

b) eliminar agua del caldo de fermentación que contiene L-metionina (concentración); c) eliminar una cantidad de 0 a 100% en peso de la biomasa formada durante la fermentación; y d) secar el caldo de fermentación obtenido según b) y/o c), para obtener el aditivo para piensos para animales

en la forma de polvo o gránulo deseada.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que adicionalmente se lleva o se llevan a cabo una o más de las siguientes etapas:

e) añadir una o más sustancias orgánicas, incluyendo L-metionina y/o D-metionina y/o la mezcla racémica D,L-metionina, a los productos obtenidos según b), c) y/o d);

f) añadir sustancias auxiliares escogidas del grupo que consiste en sílices, silicatos, estearatos, sémolas y salvado, a las sustancias obtenidas según b) a e), para la estabilización y para incrementar la capacidad de almacenamiento; o

g) convertir las sustancias obtenidas según b) a f) en una forma estable para el estómago del animal, en particular el rumen, revistiéndolas con agentes formadores de películas.

11. Un procedimiento según las reivindicaciones 9 ó 10, en el que se elimina hasta 100% de la biomasa. 10 12. Un procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, en el que el contenido de agua es hasta 5% en peso.

13. Un procedimiento según las reivindicaciones 10, 11 ó 12, en el que los agentes formadores de películas son carbonatos metálicos, sílices, silicatos, alginatos, estearatos, almidones, gomas o éteres de celulosa.