PURIFICACIÓN DE FACTOR VIII USANDO UNA RESINA DE MODO MIXTO O MULTIMODAL.

Un método para purificar una proteína de Factor VIII de coagulación que contiene uno o más contaminantes,

comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto la proteína de Factor VIII con una resina multimodal o de modo mixto que contenga ligandos que comprendan una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente; (b) eluir la proteína de Factor VIII con un tampón de elución que contenga al menos sal 1.5 M y al menos 40% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol o una mezcla de los mismos, e iones de calcio

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con un método para purificar una proteína recombinante usando una resina multimodal o de modo mixto que contiene ligandos que comprenden una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente. La proteína de interés es un factor de coagulación, particularmente relevante para la purificación de composiciones de Factor VIII recombinante.

Antecedentes de la invención

El Factor VIII humano, también conocido como factor antihemofilia o FVIII:C es una proteína plasmática humana que consiste en dos polipéptidos con peso molecular de cadena ligera de 80,000 daltons y un peso molecular de cadena pesada variable de 90,000 a 220,000. Se considera como uno de los cofactores clave en la vía de coagulación necesarios para la conversión de Factor X a su forma activa Factor Xa. El Factor VIII circula en plasma como un complejo no covalente con factor de von Willebrand (también conocido como FVIII:RP). La hemofilia, un trastorno hemorrágico es causado debido a niveles anormales de Factor VIII. Niveles de Factor VIII debajo de 20% de lo normal pueden dar como resultado condición hemofílica en humanos. Una caída en los niveles de menos de 1% de Factor VIII lleva a severos trastornos de sangrado, con sangrados articulares espontáneos siendo el síntoma más común.

La estructura y bioquímica de Factor VIII recombinante han sido descritas previamente.

Tradicionalmente, el aislamiento y purificación de Factor VIII ha sido a partir de una fuente derivada de plasma (crioprecipitado). Los procedimientos de purificación a partir de fuentes derivadas de plasma incluyen aquellos que exploran el uso de purificación por inmunoafinidad usando anticuerpos policlonales y monoclonales para la purificación de FVIII. Sin embargo, puede haber casos en los que el efluente de Factor VIII contenga cierto anticuerpo residual debido a lixiviado de la matriz de soporte, lo cual puede dar como resultado antigenicidad durante uso final, es decir, cuando se introduzca en un sistema humano o animal. Procedimientos de purificación que exploran el uso de cromatografía de intercambio iónico en, por ejemplo, esferas de agarosa también han sido usados para la purificación de Factor VIII a partir de plasma. Estos métodos, sin embargo, comúnmente sufren de ciertos niveles de contaminación del FVIII:C resultante.

Sin embargo, la purificación de Factor VIII a partir de fuentes recombinantes genéticamente manipuladas ha obtenido importancia en la última década. La recuperación de proteínas y la concentración de producto final son de principal importancia en la separación de proteínas recombinantes. Los contaminantes en proteínas producidas recombinantemente pueden incluir proteínas secretadas en el medio de cultivo, componentes del medio, lisados celulares, proteínas no deseadas producidas por las células y los ácidos nucleicos.

Cuando se purifica una proteína recombinante, los materiales de origen acuoso en los cuales los polipéptidos de interés se encuentran se observan comúnmente como contaminados con uno o más virus. Técnicas para inactivar virus en mezclas de polipéptidos se conocen en la técnica, tales como, por ejemplo, métodos químicos, soluciones que usan solventes/detergentes, métodos de irradiación o métodos térmicos, pero los intentos por combinar estas técnicas con procesos conocidos de purificación de polipéptidos han producido métodos con una multiplicidad de etapas inadecuadas para producción a gran volumen. También es importante tener precaución ya que los agentes de inactivación viral usados no desnaturalizan la proteína o son difíciles de separar de la proteína de interés. Sin embargo, estos agentes han sido ya sea desnaturalizantes o difíciles de separar del polipéptido de interés, y han requerido de tratamiento especial o etapas de separación. Otros métodos convencionales para tratar preparaciones que contienen polipéptidos para contaminación viral potencial, tales como calor o irradiación, han resultado ya sea en desnaturalización significativa del polipéptido de interés y/o inactivación insuficiente de los virus. Muchos de los productos de Factor VIII recombinante disponibles comercialmente (Advate®, Helixate®, Kogenate FS®, ReFacto®) se elaboran usando cromatografía de inmunoafinidad incluyendo un detergente para la purificación e inactivación viral.

En la purificación de proteínas terapéuticas producidas por medio de una técnica de ADN recombinante, se conoce bien que problemas considerables se encuentran cuando se intenta reducir el contenido de ADN y Proteína de Célula Huésped (HCP) hasta el nivel muy bajo deseado.

Nordfang et al. (Thrombosis and Haemostasis 58(4), 1043-1048 (1987) describe una separación usando una resina de anticuerpos y un tampón que contiene 50% de etilenglicol y alto contenido de sal.

La purificación de una proteína recombinante expresada en sistemas celulares de mamíferos se lleva a cabo típicamente en varias etapas. Las diferentes etapas normalmente se separan en captura, intermedia y pulido. El objetivo de la etapa de captura es doble; a) obtener la proteína objetivo en una forma de solución estable y b) reducir el volumen (es decir, obtener una solución concentrada con respecto al contenido de proteína en comparación con la solución cargada sobre la columna (“la carga”). La última etapa (reducción de volumen) es crítica para facilitar las etapas de purificación subsecuentes. La etapa de captura se logra comúnmente usando cromatografía con una resina de intercambio iónico. La desventaja de usar una resina de intercambio iónico es que la conductividad y/o pH de la carga tiene que ser ajustado. Cuando se ajusta la conductividad, en la mayoría de los casos reducida, esto se lleva a cabo por la adición de agua lo cual incrementa el volumen del material de partida, haciendolo impráctico para etapas subsecuentes y en general problemático para propósitos de producción. Más aún, el ajuste del pH comúnmente da como resultado la formación de agregados que podrían interferir con el rendimiento de las etapas de purificación.

Después de la etapa de captura, puede seguir una purificación intermedia, la cual elimine la mayoría de las impurezas significativas incluyendo ADN, virus y endotoxinas. Estas impurezas también pueden ser removidas/reducidas en captura. La etapa de pulido se refiere a una etapa de purificación final, en la que contaminantes residuales e impurezas son eliminados y el rendimiento es un producto biológico activo. Los contaminantes removidos durante la etapa de pulido comúnmente son conformadores de la molécula objetivo o productos de derrame sospechosos.

En lo que se refiere a protocolos de purificación del estado de la técnica, WO 2006/067230 A divulga el factor de purificación VII sobre la resina de modo mixto Capto MMC y WO 2005/014621 divulga la purificación de proteínas que contienen el dominio Ig con cromatografía de modo mixto entre los que está el factor XIII. WO 2006/103258 y WO 96/15140 A divulgan protocolos de purificación para el factor de coagulación VIII.

Aún existe la necesidad en la técnica de métodos de purificación mejorados los cuales sean rápidos y eficientes y en los cuales se conserve esencialmente la actividad de Factor VIII. El método de la presente invención es ventajoso toda vez que, en una sola etapa, proporciona una reducción de volumen y un incremento considerable en la actividad específica. Así, el método, en una sola etapa, combina una etapa de captura y una de purificación. La presente invención proporciona también un proceso eficiente para producir una solución altamente concentrada y muy pura de Factor VIII recombinante en la que la proteína de Factor VIII se estabiliza contra degradación. Con la presente invención, es posible combinar una etapa de captura y purificación sin arriesgar la desestabilización severa de las moléculas de FVIII y, en una sola etapa, obtener una purificación inicial de la muestra cruda, obtener una reducción en volumen sustancial (facilitando de esta manera etapas de purificación adicionales) así como obtener un factor de purificación sustancial (incremento en la actividad específica de FVIII) y una solución resultante (“grupo de captura”) en la que la proteína sea estabilizada contra degradación.

Breve descripción de la invención

La presente invención está relacionada con la purificación nueva y eficiente de proteínas recombinantes, especialmente Factor VIII de coagulación.... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar una proteína de Factor VIII de coagulación que contiene uno o más contaminantes, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto la proteína de Factor VIII con una resina multimodal o de modo mixto que contenga ligandos que comprendan una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente;

(b) eluir la proteína de Factor VIII con un tampón de elución que contenga al menos sal 1.5 M y al menos 40% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol o una mezcla de los mismos, e iones de calcio.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa (c) en la que se recoge la solución que contiene Factor VIII que resulta de la etapa (b).

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa (a1) en la que la columna, después de la etapa (a) y antes de la etapa (b), es pasada por uno o más tampones de lavado.

4. Método según la reivindicación 3, donde uno o más tampón(es) de lavado comprende(n) 10 mM a 1,000 mM de sal.

5. Método según la reivindicación 4, donde el tampón de lavado contiene sal 0.5-0.8 M.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el tampón de elución de la etapa (b) contiene al menos sal 2M y al menos 45% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol o una mezcla de los mismos.

7. Método según la reivindicación 6, donde el tampón de elución de la etapa (b) contiene sal 2.3-2.6 M y 48-52% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol, o una mezcla de los mismos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la sal contenida en el tampón de elución de la etapa (b) se selecciona de: NaCl, NH4Cl, KCl, (NH4)2SO4, CH3CO2NH4, o una mezcla de dos o más de estos.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque el tampón de elución contiene NaCl y etilenglicol.

10. Método según la reivindicación 1, donde el tampón de elución contiene iones de calcio a una concentración de 1 mM a 100 mM.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la etapa (a) se lleva a cabo:

(i) a un pH equivalente al pH de la solución de carga, y/o

(ii) sin el ajuste de conductividad.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la proteína de Factor VIII es seleccionada a partir del grupo que consiste en: Factor VIII de longitud completa, FVIII:C, versiones con dominio B suprimido de Factor VIII, derivados pegilados de Factor VIII, derivados polisialilados de Factor VIII y combinaciones de los mismos, de preferencia versiones de Factor VIII de dominio B suprimido.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el tampón de elución en la etapa (b) comprende 20 mM de imidazol, 10 mM de CaCl2, 0.02% (p/v) de Tween 80 y NaCl 2.5M y etilenglicol 8M a pH de alrededor de 7.5.

14. Método de una sola etapa para purificar proteína de Factor VIII que contiene uno o más contaminantes, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la proteína con una resina multimodal que contiene los ligandos que comprenden una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente;

b) eluir la proteína con un tampón de elución que contiene al menos sal 1.5 M y al menos 40% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol o una mezcla de los mismos, e iones de calcio; en donde el método logra una reducción en volumen de columna de aproximadamente 250 veces.

15. Método de una sola etapa para purificar proteína de Factor VIII que contiene uno o más contaminantes, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la proteína con una resina multimodal que contiene los ligandos que comprenden una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente; b) eluir la proteína con un tampón de elución que contiene al menos sal 1.5 M y al menos 40% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol, o una mezcla de los mismos, e iones de calcio; en donde el método logra un “factor de purificación” de al menos 30 veces.

16. Método para estabilizar proteína de Factor VIII, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la proteína con una resina multimodal que contenga los ligandos que comprendan una parte hidrófoba 10 y una parte cargada negativamente;

b) eluir la proteína con un tampón de elución que contenga al menos sal 1.5 M y al menos 40% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol, una mezcla de los mismos, e iones de calcio.