PROTEÍNA DE CANAL DE POTASIO TREK-1 HUMANA Y DE RATÓN Y SU USO.

Proteína de canal de potasio TREK-1 humana y de ratón y su uso FUNDAMENTO DEL INVENTO 1. Campo del invento El invento se refiere a un método para identificar sustancias que son capaces de actuar como anestésicos. 2. Fundamento de la técnica relacionada Los anestésicos volátiles son una clase notable de agentes que producen un estado seguro y reversible de inconsciencia con amnesia y analgesia concurrentes. Ejercen una acción hiperpolarizante sobre las neuronas de mamífero. Activan una corriente de K + sináptica inhibitoria (IK(An)) en las neuronas marcapasos de molusco, de la que se ha propuesto que desempeña un papel importante en la anestesia general. Los anestésicos volátiles hiperpolarizan neuronas motoras de rana, neuronas hipocampales de rata, neuronas talámicas de cobaya y neuronas de la corteza cerebral humana. Por lo tanto, se ha propuesto que el mecanismo molecular de los anestésicos volátiles implica la acción de una clase específica de canales de K + . El hecho de que una corriente de K + sináptica inhibitoria particular, IK(An), activada reversiblemente por agentes volátiles, esté presente en las neuronas marcapasos de molusco sensibles a anestésicos pero ausente en las neuronas insensibles ha hecho de ella un candidato muy atractivo como diana para estos importantes agentes farmacológicos. La IK(An) actúa como un canal de fondo; no depende del voltaje, se activa inmediatamente y no se inactiva con el tiempo. La IK(An) obedece la ecuación del campo constante de Goldman-Hodgkin-Katz y es resistente al tetraetilamonio y la 4-aminopiridina, dos bloqueadores clásicos del canal de K + . Lopes et al., "Action of general anaesthetics and arachidonic acid pathway inhibitors on K+ currents activated by volatile anaesthetics and FMRFamide in molluscan neurones", British Journal of Pharmacology (1998) 125, 309-318, describen el estudio de corrientes de K+ activadas por anestésicos generales volátiles. En particular, en este documento se describe la activación de corrientes de fondo por anestésicos volátiles. Hemos identificado recientemente una nueva familia de canales de K+ de mamífero con un motivo estructural único que consiste en dos dominios de poro en tándem y cuatro segmentos transmembranales. Los cuatro miembros de esta familia, que se muestran en la Figura 1A, han sido clasificados como TWIK-1, TASK, TREK-1 y TRAAK. Se ha mostrado previamente que TWIK-1 se dimeriza, lo que implica que un canal funcional está formado por al menos dos subunidades. No se produce heteromultimerización entre los cuatro miembros de esta nueva familia, como se prueba en células Sf9 que expresan diversas combinaciones de estos canales (datos no publicados). Tres miembros de esta familia, TREK-1 de ratón, TRAAK de ratón y TASK humano, codifican rectificadores de K+ de fondo hacia fuera con propiedades que se parecen a las de IK(An). TRAAK y TREK-1 son directamente abiertos por el ácido araquidónico y otros ácidos grasos poliinsaturados, mientras que TASK codifica un canal de K+ en reposo que es controlado por variaciones de pH externas próximas al pH fisiológico. TREK-1 y TASK se expresan en muchos tejidos y son particularmente abundantes en el cerebro y en el corazón, mientras que TRAAK se expresa selectivamente en el sistema nervioso central. Se detecta expresión neuronal de estos canales con niveles elevados en la corteza, el cerebelo, el hipocampo y el bulbo olfativo, y se detecta expresión cardiaca tanto en el tejido miocárdico como en el conjuntivo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS ES 2 366 080 T3 Figura 1. Se muestran los resultados de experimentos con cloroformo que demuestran que el cloroformo activa selectivamente TREK-1: A, un esquema que muestra los dos dominios de poro y los cuatro dominios transmembranales de los canales de potasio K+ de dominio 2P, TREK-1, TRAAK, TWIK-1 y TASK. Los cuatro segmentos de dominio transmembranal se indican mediante TM1 a TM4, y las dos regiones de poro se indican mediante P1 y P2. El arbol filogenético indica las tres subfamilias. TWIK-1 es un canal rectificador de K+ hacia dentro y TASK es un canal rectificador de K+ de fondo inhibido por acidosis externa. Tanto TREK-1 como TRAAK son canales rectificadores de K+ de fondo hacia fuera, abiertos por el ácido araquidónico; B, experimentos de pinzamiento zonal ("patch-clamp") de célula completa que muestran que cloroformo 0,8 mM activa intensa y reversiblemente TREK-1 expresado en células COS transfectadas. El estado simulado es el vector de expresión de tipo silvestre (vacío). Se investigaron los efectos del cloroformo sobre las corrientes de K+ provocadas en la configuración de célula completa durante una rampa de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV, como se ilustra en la inserción para TREK-1; C, el cloroformo 0,8 mM indujo una típica corriente de fondo caracterizada por una rectificación hacia fuera que se invierte en el valor predicho para EK+. Se examinaron corrientes de TREK-1 activadas por cloroformo en gradientes de K+ fisiológicos y simétricos. Se restaron digitalmente rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV en ambos estados de K+ y en presencia de cloroformo 0,8 mM, de las rampas en las condiciones testigo; D, el cloroformo 0,8 mM hiperpolarizó reversible y reproduciblemente células COS que expresan TREK-1; E, dependencia de la dosis en la activación de TREK-1. La inserción ilustra el efecto del cloroformo 0,8 mM sobre la corriente de TREK-1 medida en un potencial de fijación de 0 mV. Se indica el número de células en cada estado experimental. 2 Figura 2. El halotano es un activador común de TREK-1 y TASK. A, efectos comparativos del halotano 1 mM sobre las actividades de canales de K+ de dominio 2P. El estado simulado es el vector de expresión de tipo silvestre (vacío); B, el halotano (1 mM) estimula la actividad del canal TASK provocada en la configuración de célula completa durante rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV; C, corrientes de TASK activadas por halotano (1 mM) en gradientes de K+ fisiológicos y simétricos. Se restan digitalmente rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV en ambos estados de K+ y en presencia de halotano 1 mM, de las rampas en las condiciones testigo; D, curva de dosis-efecto del halotano sobre la activación del canal TREK-1; F, el halotano (1 mM) activa reversiblemente TASK en un potencial de fijación de 0 mV. Se indica el número de células en cada estado experimental. Figura 3. El isoflurano y el éter dietílico activan diferencialmente TREK-1 y TASK. A, efectos comparativos del isoflurano 2 mM (A) y el éter dietílico 0,6 mM (B) sobre los canales de K+ de dominio 2P. El estado simulado es el vector de expresión de tipo silvestre (vacío). Se investigan los efectos de los anestésicos sobre las corrientes de K+ provocadas en la configuración de célula completa durante rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV, como se ilustra en las inserciones para TREK-1. Se indica el número de células en cada estado experimental. Figura 4. Anestésicos volátiles estimulan TREK-1 y TASK en las configuraciones de zona escindida ("excised patch"). A, efectos de concentraciones crecientes de halotano sobre la actividad del canal TREK-1 en una zona de cara externa hacia fuera ("outside-out patch"). En una zona de cara externa hacia fuera, el halotano abre reversiblemente un canal TREK-1 de 48 pS de un modo dependiente de la dosis. El potencial de fijación es 0 mV, y las aplicaciones de halotano se indican mediante barras horizontales; B, efecto del cloroformo 0,8 mM sobre la curva I-V de TREK-1 en una zona de cara externa hacia fuera. Se obtiene la curva I-V con una rampa de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV; C, cinética de activación de TREK-1 por cloroformo 0,8 mM. La curva I-V de la corriente sensible al cloroformo en una zona de cara externa hacia fuera muestra la característica rectificación hacia fuera; D, el halotano (1 mM) provoca la apertura del canal TASK en una zona de cara interna hacia fuera ("inside-out patch"). El potencial de fijación es 0 mV, y de izquierda a derecha se ilustran las actividades de canal antes, durante y después de la adición de halotano 1 mM. El halotano abre reversiblemente un canal TASK de 12 pS. Figura 5. Caracterización funcional del TREK-1 humano (hTREK-1). Se someten células COS transitoriamente transfectadas que expresan hTREK-1 a fijación de voltaje ("voltage clamp") usando la configuración de pinzamiento zonal de célula completa. A, se registra la corriente basal de TREK-1 en condiciones fisiológicas de K (5 mM) y en condiciones simétricas de K (155 mM). Se fijan las células a -80 mV... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar sustancias que tienen propiedades anestésicas tras su inhalación, que comprende: (a) poner dicha sustancia en contacto con una proteína de transporte de potasio de mamífero, en que dicho 5 transporte de potasio presenta rectificación de potasio hacia fuera; y (b) determinar la actividad de transporte de potasio de dicha proteína de transporte de potasio, en que una activación del transporte de potasio es indicativa de que dicha sustancia tiene dichas propiedades anestésicas, en que dicha proteína de transporte de potasio de mamífero es TASK de secuencia ID. SEC. nº 5. 2. El método de la Reivindicación 1, que comprende: ES 2 366 080 T3 10 (a) poner dicha sustancia en contacto con células transfectadas, en que dichas células transfectadas están transfectadas con un vector nucleotídico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica dicho TASK, en que dichas células transfectadas expresan transitoriamente dicho TASK en una superficie de dichas células transfectadas, y en que dicho TASK presenta rectificación de potasio hacia fuera; y (b) determinar la actividad de transporte de potasio de dicho TASK, en que una activación del transporte de 15 potasio es indicativa de que dicha sustancia tiene dichas propiedades anestésicas. 3. El método de la Reivindicación 2, en que dichas células transfectadas son seleccionadas del grupo que consiste en Spodoptera, ovocitos de Xenopus, células de ovario de hámster chino y fibroblastos. 19 ES 2 366 080 T3 ES 2 366 080 T3 21 ES 2 366 080 T3 22 ES 2 366 080 T3 23 ES 2 366 080 T3 24