La presente invención se refiere a una secuencia de promotor denominada FSP1 (SEQ ID NO:

2), situada en la región 5'' del DNA del gen Sn1 de tomate Solanum lycopersicum. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, células de plantas y plantas transgénicas que comprenden el promotor, así como a las semillas y los frutos de las mismas. El promotor puede usarse para dirigir la expresión génica sentido, antisentido, miRNA o RNAi específicamente en tejidos del fruto. Aunque se han descrito otros promotores específicos de fruto en el tomate, el FSP1 de tomate es particularmente útil cuando se desea usar un promotor de tomate que confiera expresión específica en el fruto en diferentes estadios pero especialmente durante la maduración y específicamente en los tejidos de la columnela, placenta y gel interlocular y cuando se desea que los niveles de expresión resultantes sean moderados o bajos

Promotor específico del fruto de Solanum lycopersicum.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a una secuencia de promotor denominada FSP1 (SEQ ID NO:2), situada en la región 5' del DNA del gen Sn1 de tomate Solanum lycopersicum. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, células de plantas y plantas transgénicas que comprenden el promotor, así como a las semillas y los frutos de las mismas. El promotor puede usarse para dirigir la expresión génica sentido, antisentido, miRNA o RNAi específicamente en tejidos del fruto. Aunque se han descrito otros promotores específicos de fruto en el tomate, el FSP1 de tomate es particularmente útil cuando se desea usar un promotor de tomate que confiera expresión específica en el fruto en diferentes estadíos pero especialmente durante la maduración y específicamente en los tejidos de la columnela, placenta y gel interlocular y cuando se desea que los niveles de expresión resultantes sean moderados o bajos.

Antecedentes de la invención

Los promotores son elementos reguladores que dirigen la expresión de genes. Tanto los promotores constitutivos como los reguladores se usan para dirigir la expresión génica en organismos transgénicos incluyendo plantas.

Los promotores constitutivos dirigen la expresión en la mayoría o en todos los tejidos, y son de utilidad cuando niveles altos de producción de un producto génico son deseados en toda la planta. El promotor 35S de virus del mosaico de la coliflor (VMC) es el promotor que se usa más frecuentemente para dirigir niveles altos de expresión constitutiva en plantas.

Los promotores reguladores, tales como promotores específicos de tejido, específicos de órgano e inducibles, se usan para dirigir la expresión espacial o temporalmente específica o la expresión en respuesta a factores ambientales.

Con respecto a los promotores regulados, se han descrito en el tomate varios promotores que confieren altos niveles de expresión en el fruto, especialmente para dirigir la expresión en el pericarpio del fruto en maduración. La mayoría de estos promotores se expresan principalmente tras el inicio del estadio de maduración. Entre ellos se encuentran el promotor E8 de tomate (Ramirez et al, Clin Vaccine Immul 2007, 14, 685-692, Lincoln et al 1987), el promotor de poligalacturonasa (Montgomery et al 1993, Nicholas et al 2004) el promotor E4 o las versiones sintéticas de E4 y E8 (patente US patent 6118049), los promotores TMF7 y TMF9 (patente US patent número 5608150, patente de los Estados Unidos 20070094749), y el promotor 2A11 de tomate (van Haaren y Houck, 1991), entre otros.

Así, por ejemplo, el contenido en sólidos del fruto de tomate puede ser aumentado mediante la expresión de un gen de ADP-glucosa pirofosforilasa bajo el control de un promotor específico de fruto. (Kishore, solicitud PCT WO 91/19806). El promotor del clon genómico 2A11 (Pear, et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:639-651) controla la expresión de la ADP-glucosa pirofosforilasa en el fruto de tomate. Es conocido que los promotores E4 y E8 (Deikman, et al. (1988) The EMBO Journal 7:3315-3320), así como el promotor para la poligalacturonasa son específicos de fruto. Sin embargo, los tres últimos están limitados a altos niveles de expresión durante un estadio tardío del desarrollo del fruto de tomate y por tanto, no cubren los estadios restantes de desarrollo del fruto durante los cuales podría resultar de interés dirigir la expresión de un gen recombinante. Estos promotores son conocidos como promotores de frutos rojos. Adicionalmente, todos ellos dirigen una expresión elevada en el fruto, y generalizada en todos sus tejidos, lo cual no es deseado en aquellos casos en los que sólo es necesario que el producto génico se acumule en concentraciones medias o bajas en algunos tejidos del fruto para ejercer su función y/o cuando altos niveles podrían ser perjudiciales para la planta, como es el caso de genes de hormonas o genes implicados en el desarrollo. Por tanto, existe una necesidad de identificación de promotores alternativos que den lugar a una expresión entre moderada y baja de un gen en el fruto durante diferentes estadios del desarrollo y especialmente durante la maduración.

Casos especiales son los promotores obtenidos a partir de las mismas especies que van a ser modificadas o de especies sexualmente compatibles. Esto resulta particularmente importante cuando se desea un enfoque de "cisgenesis" o "intragenesis" en vez de un enfoque transgénico. Por "Cisgenesis" se entiende una modificación genética (= GM; normalmente mediante técnicas de DNA recombinante) de plantas con una secuencia de DNA o gen de la misma planta de cultivo que va a ser transformada o de plantas donadoras sexualmente compatibles que pueden usarse en el cultivo de plantas tradicionales. En la práctica, se restringe a genes que codifican para características heredadas de modo dominante. El gen pertenece al conjunto de genes del cultivador. La planta modificada genéticamente con cisgenes es una planta cisgénica (Cisgenic plants are similar to traditionnally bred plants. Schouten, H.J., Krens, F.A., Jacobsen, E., 2006. EMBO Reports 7: 750-753; "Cisgenic" as a product designation, Schubert D & Williams D. 2006. Nature Biotechnology 24: 1327-1329. A diferencia de un transgén que se define como un gen o secuencia de DNA de especies no sexualmente compatibles o una secuencia de DNA o gen sintético. La planta modificada genéticamente correspondiente que contiene transgenes es una planta transgénica.

Por tanto, la identificación de un promotor específico de fruto de tomate que funcione en el fruto en diferentes estadios del desarrollo es altamente deseable dado que esto facilitará enfoques cis o intragénicos eficientes. Especialmente cuando se desean niveles de expresión en el fruto entre bajos y moderados.

La presente invención se refiere a un promotor que dirige la expresión específica de genes en plantas. El presente promotor se deriva de un gen de función desconocida denominado Sn1 de Solanum lycopersicum, que dirige la expresión específica de genes en el fruto de plantas, en niveles entre moderados y bajos durante diferentes estadios de desarrollo, que lo hace especialmente adecuado para aquellos casos en los que el producto génico solo necesita ser acumulado en bajos niveles en el fruto para realizar su función, y/o cuando altos niveles podrían ser perjudiciales para la planta, como es el caso de genes de hormonas o genes implicados en el desarrollo.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a un promotor aislado derivado de un gen de tomate Solanum lycopersicum. En una realización particular este gen es el gen Sn-1. En otra realización particular, el promotor tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2. Este promotor es de especial utilidad fusionado a secuencias de DNA apropiadas, para dirigir la expresión génica específica sentido, miRNA, antisentido o RNAi en el fruto en todos los estadios de desarrollo.

Este promotor específico de fruto de tomate puede ser de especial interés para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés de especies relacionadas dentro de Solanaceae/Solanum a la que pertenece el tomate, pudiendo obtenerse niveles de expresión bajos y/o moderados en el fruto, sin la necesidad de emplear promotores heterólogos. Es decir, el promotor de la invención presenta interés en la introgresión dirigida de genes dentro de las Solanaceae/Solanum empleando una estrategia en la que todas las secuencias utilizadas son de Solanaceas/Solanum.

La expresión de Sn1 no se detecta en genotecas de expresión de órganos vegetativos, mientras que en genotecas de fruto de tomate no supera el 3,5% de abundancia relativa (estimado según Fei et al, 2004). Asimismo los estudios de expresión relativa de SN1 mediante PCR cuantitativa muestran niveles de expresión en fruto al menos 20 veces mayores que en tejidos vegetativos (figura 1). Esto indica que SN1 se expresa de forma específica en el fruto y a niveles moderados o bajos (menores del 3,5% de abundancia relativa (estimado según Fei et al, 2004), lo que lo hace a su promotor especialmente adecuado para aquellos casos en los que sólo es necesario que el producto génico se acumule a bajos niveles en el fruto para ejercer su función y/o cuando altos niveles podrían ser perjudiciales para...

1. Promotor específico de la fruta FSP1 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 o al menos una secuencia que presenta el 70% de homología con SEQ.ID.NO.2.

2. Construcción nucleotídica caracterizada por comprender el promotor según reivindicación 1 operativamente unido a un gen o secuencia de DNA de interés que da lugar a la producción de una secuencia de RNA que codifica para una proteína o péptido de interés.

3. Construcción nucleotídica según reivindicación 2 caracterizada porque dicha secuencia de DNA o gen de interés es homólogo o heterólogo al promotor según reivindicación 1.

4. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-3 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés presenta utilidad en plantas biofactoría (molecular pharming).

5. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-4 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés es de utilidad en la producción de medicamentos.

6. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-5 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés es una hormona.

7. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-5 caracterizada porque dicha proteína interviene en la síntesis, en la percepción o en la señalización de una hormona.

8. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-7 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés es el producto de un gen implicado en el desarrollo.

9. Vector que comprende la construcción nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

10. Célula de planta que comprende la construcción nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

11. Célula de planta según la reivindicación 10 donde dicha planta pertenece al género Solanum.

12. Célula de planta según reivindicación 11 donde dicha planta es Solanum lycopersicum.

13. Célula de planta según reivindicación 10 donde dicha planta pertenece a cualquier especie de plantas que presenten fruto.

14. Célula de planta según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 donde la proteína o péptido de interés es heterólogo a dicha planta.

15. Célula de planta según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 donde dicha proteína o péptido pertenece a la especie Solanum.

16. Célula de planta según reivindicación 15 donde dicha proteína o péptido de interés pertenece a Solanum lycopersicum.

17. Planta transgénica que comprende la construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-8.

18. Planta transgénica según reivindicación 17 caracterizada por pertenecer al género Solanum.

19. Planta transgénica según reivindicación 18 caracterizada por ser Solanum lycopersicum.

20. Planta transgénica según reivindicación 17 caracterizada por pertenecer a cualquier especie de plantas que den fruto.

21. Semilla de planta según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

22. Fruto de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

23. SEQ ID NO: 2.

24. Uso del promotor según reivindicación 1 para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés en plantas caracterizado porque dicha expresión se produce exclusivamente en el fruto de la planta en niveles bajos y/o moderados, durante todos los estadios de desarrollo.

25. Uso del promotor según reivindicación 24, caracterizado porque la expresión en el fruto se da preferentemente en columnella, placenta, alrededores de la semilla y gel interlocular y en menor cantidad en el pericarpio.

26. Uso del promotor según reivindicaciones 24-25 caracterizado porque dicha expresión en el fruto es entre el 1% y el 10% de la obtenida en el fruto de la planta al emplear promotor 35 S.

27. Uso del promotor según reivindicaciones 24-26 caracterizado porque los niveles de expresión en el fruto es preferentemente el 10% de la obtenida en el fruto de la planta al emplear promotor 35 S.

28. Uso del promotor según reivindicaciones 24-27 caracterizado porque la expresión de los genes de interés que dirige, se produce durante diferentes estadíos de desarrollo del fruto.

29. Uso del promotor según reivindicaciones 24-28 caracterizado porque la expresión en el fruto se da en mayor nivel en el estadío de maduración.

30. Uso del promotor según reivindicaciones 24-29 para dirigir la expresión de amplicones derivados de vectores vírales de forma específica en el fruto y a niveles bajos y moderados.

31. Uso del promotor según reivindicación 30 caracterizado porque dicho amplicón contiene la secuencia de un gen de interés que codifica un péptido de aplicación en plantas biofactoría (molecular pharming).

32. Uso del promotor según reivindicación 30 caracterizado porque dicho péptido tiene aplicación en la producción de un medicamento.

33. Uso del promotor según reivindicaciones 24-32 en la modificación de la composición substancial del fruto para otorgarle nuevas características nutricionales, organolépticas o agronómicas

34. Uso del promotor según reivindicaciones 24- 33 en estrategias de tipo "plantas biofactoría".

35. Uso del promotor según reivindicaciones 24-37 para la expresión de proteínas que solo necesitan acumularse en concentraciones medias o bajas en el fruto para ejercer su función.

36. Uso del promotor según reivindicaciones 24-35 para la expresión de proteínas cuya acumulación en niveles altos resulta nocivo para la planta.

37. Uso del promotor según reivindicaciones 24-36 en expresión dirigida en los diferentes estadios de desarrollo del fruto especialmente en la columnela, tejido locular y en menor medida en el pericarpio.