La presente invención se refiere a una secuencia promotora (SEQ ID NO:

2), derivada de un gen de Solanum lycopersicum, de función desconocida y denominado CNH1. La invención está dirigida a las construcciones nucleotídicas, vectores, células de plantas y plantas transgénicas que comprenden el promotor de la invención, así como a sus semillas. El promotor constitutivo de la invención es útil para la expresión génica sentido, miRNA, antisentido o RNAi de las secuencias de DNA a las que se fusiona, en todos los órganos de la planta, con niveles especialmente elevados en el fruto. El promotor es de especial interés cuando niveles de expresión similares a los obtenidos por el promotor CaMV 35S son deseados en el fruto durante diferentes estadios de su desarrollo, pero no de forma tan elevada en el resto de la planta, especialmente dentro de Solanaceae/Solanum, permitiendo evitar el empleo de promotores heterólogos

Promotor constitutivo de Solanum lycopersicum.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a una secuencia del promotor CNH1 (SEQ ID NO:2) derivada de un gen de tomate Solanum lycopersicum con función desconocida, denominado CNH1 -de Constitutive No Hits number 1. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, células de plantas y plantas transgénicas que comprenden el promotor así como a las semillas de las mismas. El promotor es de utilidad cuando se fusiona a secuencias de DNA apropiadas para dirigir la expresión génica sentido, miRNA, antisentido o RNAi en todos los órganos de la planta y especialmente con niveles altos en el fruto.

Antecedentes de la invención

Los promotores son elementos reguladores que dirigen la expresión de genes. Tanto los promotores constitutivos como los reguladores se usan para dirigir la expresión génica en organismos transgénicos incluyendo plantas.

Los promotores constitutivos dirigen la expresión en la mayoría o en todos los tejidos, y son de utilidad cuando niveles altos de producción de un producto génico son deseados en toda la planta. El promotor 35S de virus del mosaico de la coliflor (VMC) es el promotor que se usa más frecuentemente para dirigir niveles altos de expresión constitutiva en plantas.

Los promotores reguladores, tales como promotores inducibles y específicos de tejido, se usan para dirigir la expresión espacial o temporalmente específica o la expresión en respuesta a factores ambientales.

Con respecto a promotores constitutivos, de lejos el promotor CaMV35S es el promotor usado más frecuente- mente en biotecnología de plantas (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition, http://www.cfsan.fda.qov/∼Ird/biocon.html). Diferentes versiones derivadas de este promotor (incluyendo las sintéticas) han sido empleadas (Fang, R.X., Nagy, F., Sivasubramaniam, S. y Chua, N.H. 1989. Multiple cis regulatory elements for maximal expression of the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenics plants. Plant Cell 1: 141-150; patente US Patent 6072050; patente US Patent 6555673). Se ha demostrado que este promotor es de utilidad para dirigir buenos niveles de expresión cuando es clonado frente a un gen de interés, en casi todas las plantas dicotiledóneas en las que ha sido testado (incluyendo Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Lycopersicon esculentum, Zea mays y Oryza sativa, etc.) (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition, http://www.cfsan.fda.qov/∼Ird/biocon.html). En monocotiledóneas/gimnospermas este promotor 35S no ha sido ampliamente usado, y la preferencia es para el promotor ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA, Quail PH(1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol 18: 675, 689) o el "superpromotor" (Ni M, Cui D, Einstein J, Narasimhulu S, Vergara C, Gelvin S (1995) Strength and Tissue specificity of chimeric promotors derived from octopine and mannopine synthase genes. Plant J 7, 651-676). Se han descrito otros promotores en plantas para conferir niveles moderados de expresión constitutiva, pero no han sido ampliamente usados. Este es el caso del promotor CmYLCV (Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) promoter: a new strong constitutive promoter for heterologous gene expression in a wide variety of crops, Stavolone et al. (2003) Plant molecular biology 53, pp. 663-673) y del promotor constitutivo de tabaco en patente US Patent 5824872, entre otros.

En el género Solanum (incluye tomate, patata, pimiento, tabaco, etc.) casi todas las expresiones llevadas a cabo bajo promotores constitutivos hicieron uso del promotor CaMV35S. En algunos casos puede ser deseable diseñar mediante ingeniería una secuencia de DNA o un gen de interés sometido a un promotor que un menor nivel en los tejidos vegetativos de modo que no compromete el crecimiento de la planta, siendo el promotor capaz de dirigir niveles altos de expresión en el fruto para producir la modificación deseada en este órgano (es decir afectando a las características del fruto o acumulación de una proteína extraña). También han sido descritos promotores específicos de fruto de tomate, tal como E8 (Nicholass et al, 1995), PG (Bañaren et al, 1991), 2A11 (Deikman et al, 1992), que dirigen la expresión génica en el fruto. Sin embargo funcionan de modo preferencial durante el desarrollo tardío del fruto, especialmente durante la maduración, y por tanto no cubren los estadios de desarrollo del fruto restantes en los que dirigir la expresión de un gen recombinante podría ser deseable.

Por tanto, la identificación de un promotor alternativo que preferentemente confiera altos niveles de expresión en el fruto durante diferentes estadios de desarrollo, pero con un nivel de expresión menor en los tejidos vegetativos es altamente deseable.

Casos especiales son los promotores obtenidos a partir de las mismas especies que van a ser modificadas o de especies sexualmente compatibles. Esto resulta particularmente importante cuando se desea un enfoque de "cisgenesis" o "intragenesis" en vez de un enfoque transgénico. Por "Cisgenesis" se entiende una modificación genética (= GM; normalmente mediante técnicas de DNA recombinante) de plantas con una secuencia de DNA o gen de la misma planta de cultivo que va a ser transformada o de plantas donadoras sexualmente compatibles que pueden usarse en el cultivo de plantas tradicionales. En la práctica, se restringe a genes que codifican para características heredadas de modo dominante. El gen pertenece al conjunto de genes del cultivador. La planta modificada genéticamente con cisgenes es una planta cisgénica (Cisgenic plants are similar to traditionnally bred plants. Schouten, H.J., Krens, F.A., Jacobsen, E., 2006. EMBO Reports 7: 750-753; "Cisgenic" as a product designation, Schubert D & Williams D. 2006. Nature Biotechnology 24: 1327-1329. A diferencia de un transgén, que se define como un gen o secuencia de DNA de especies no sexualmente compatible o una secuencia de DNA o gen sintético. La planta modificada genéticamente correspondiente que contiene transgenes es una planta transgénica.

Por tanto, la identificación de un promotor constitutivo de tomate que preferiblemente funcione en el fruto en diferentes estadios de su desarrollo es altamente deseable ya que facilitaría enfoques cis o intragénicos eficientes. Esto resultaría especialmente interesante cuando se requieren niveles altos de expresión en el fruto en estadios de desarrollo diferentes de la maduración.

El promotor descrito en el presente documento puede ser usado en todas las especies de plantas como alternativa a CaMV35S pero es de especial aplicación en el género Solanum para conferir expresión constitutiva de genes o secuencias de DNA de interés con niveles particularmente altos en el fruto, en todos los estadios de desarrollo. En el caso de cisgenesis o intragenesis, cualquier característica deseada debido a un alelo dominante disponible en el conjunto génico en las especies sexualmente compatibles puede ser aislada, posteriormente sometida al control del promotor CNH y ser introducida en tomate o especies relacionadas para conferir la característica de interés.

La presente invención proporciona un promotor que dirige niveles altos de expresión de genes o secuencias de DNA en plantas, especialmente altos en el fruto. Este promotor deriva de un gen de función desconocida de Solanum lycopersicum que se expresa de modo ubicuo en toda la planta. Este promotor de tomate puede ser de especial interés para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés de especies relacionadas dentro de Solanaceae/Solanum (el tomate pertenece a este género) de modo que pueden lograrse niveles altos de expresión (similares a CaMV35S en el fruto) sin necesidad de usar promotores heterólogos y por tanto es de interés para la introducción dirigida de genes" dentro de Solanaceae/Solanum usando una estrategia en la que todas las secuencias son de Solanaceae/Solanum".

Adicionalmente, según la presente invención, el promotor de la invención, derivado de CNH1, puede dirigir niveles altos de expresión constitutiva de secuencias de DNA o...

1. Promotor constitutivo CNH1 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 o al menos una secuencia que presenta el 70% de homología con SEQ.ID.NO.2.

2. Construcción nucleotídica caracterizada por comprender el promotor según reivindicación 1 operativamente unido a un gen o secuencia de DNA de interés que da lugar a la producción de una secuencia de RNA que codifica para una proteína o péptido de interés.

3. Construcción nucleotídica según reivindicación 2 caracterizada porque dicha secuencia de DNA o gen de interés es homólogo o heterólogo al promotor según reivindicaciones 1 a 2.

4. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-3 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés presenta utilidad en plantas biofactoría (molecular pharming).

5. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-4 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés es de utilidad en la producción de medicamentos.

6. Construcción nucleotídica según reivindicaciones 2-5 caracterizada porque dicha proteína o péptido de interés es una inmunoglobulina.

7. Construcción nucleotídica según reivindicación 6 caracterizada porque dicha inmunoglobulina es IgGA.

8. Vector que comprende la construcción nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

9. Célula de planta que comprende la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

10. Célula de planta según la reivindicación 9 donde dicha planta pertenece al género Solanum.

11. Célula de planta según reivindicación 10 donde dicha planta es Solanum lycopersicum.

12. Célula de planta según reivindicación 11 donde dicha planta pertenece a cualquier especie de plantas que presenten fruto.

13. Célula de planta según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 donde la proteína o péptido de interés es heterólogo a dicha planta.

14. Célula de planta según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 donde dicha proteína o péptido pertenece a la especie Solanum.

15. Célula de planta según reivindicación 14 donde dicha proteína o péptido de interés pertenece a Solanum lycopersicum.

16. Planta transgénica que comprende la construcción nucleotídica según reivindicaciones 2 a 7.

17. Planta transgénica según reivindicación 16 caracterizada por pertenecer al género Solanum.

18. Planta transgénica según reivindicación 17 caracterizada por ser Solanum lycopersicum.

19. Planta transgénica según reivindicación 16 caracterizada por pertenecer a cualquier especie de plantas que den fruto.

20. Semilla de planta según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

21. Fruto de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

22. SEQ ID NO: 2.

23. Uso del promotor según reivindicación 1 para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés en plantas caracterizado porque dicha expresión se produce en altos niveles en toda la planta, con niveles mayores en el fruto.

24. Uso del promotor según reivindicación 23 caracterizado porque dicha expresión en el fruto es similar a la obtenida en toda la planta al emplear promotor 35 S.

25. Uso del promotor según reivindicaciones 23-24 caracterizado porque los niveles de expresión en el resto de la planta aproximadamente un orden de magnitud inferior que en el fruto.

26. Uso del promotor según reivindicación 25 caracterizado porque dicha expresión en el resto de la planta es de 3 a 6 veces inferior que en el fruto.

27. Uso del promotor según reivindicaciones 24-26 caracterizado porque la expresión de los genes de interés que dirige, se produce durante todos los diferentes estadíos de desarrollo de la planta y del fruto.

28. Uso del promotor según reivindicaciones 23 a 27 para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés en plantas cuando más de un promotor constitutivo es necesario para expresar dos o más proteínas recombinantes de forma concertada y preferentemente en el fruto.

29. Uso del promotor según reivindicaciones 23 a 28 en estrategias de tipo "plantas biofactoría".