Un procedimiento de producción de ácido N-acetilneuramínico que comprende:

(i) un cultivo de un microorganismo con actividad ácido N-acetilneuramínico sintetasa, o un producto de tratamiento del cultivo (ii) un cultivo de un microorganismo capaz de producir ácido fosfo-enol pirúvico, o un producto de tratamiento del cultivo (iii) N-acetilmanosamina (iv) una fuente de energía necesaria para la formación de ácido fosfo-enol pirúvico presentes en un medio acuoso para formar y acumular ácido N-acetilneuramínico en el medio acuoso; y -recuperar el ácido N-acetilneuramínico del medio acuoso donde dicho microorganismo capaz de producir ácido fosfo-enol pirúvico es un microorganismo que pertenece al género Escherichia o al género Corynebacterium, y donde dicho producto de tratamiento del cultivo es un producto de tratamiento del cultivo seleccionado entre el grupo que consiste en el cultivo concentrado, el cultivo seco, las células obtenidas por centrifugación del cultivo

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido N-acetilneuramínico utilizando un microorganismo que tenga actividad N-acetilneuramínico aldolasa o actividad Nacetilneuramínico sintetasa.

Se sabe que el ácido N-acetilneuramínico se puede producir por extracción, descomposición o utilizando enzimas.

Un ejemplo de un método conocido de extracción es la extracción a partir de un nido de petrel, etc. [Carbohydrate Research, 56, 423 (1977)]

La solicitud de patente japonesa JP 19920349633 (patente JP3151982) describe la preparación de fosfo-enol piruvato. La purificación de una sintetasa del acido N-neuraminidico de E. coli también ha sido descrita (Vann et al., 1997, Glycobiology 7, pag. 697-701). La publicación de Warren et al., Biochem. Biophys. Research Communs. (1961), 4, 232-5 describe una enzima de hígado de rata, que cataliza la síntesis del ácido N-acetilneuraminídico a partir de fosfo-enol pirúvico y N-acetilmanosamina. La solicitud de patente japonesa La solicitud de patente japonesa JP 08178604 (publicación 10004961; patente nº JP39448866) describe el uso de una nueva sintasa del ácido N-acetilneuramínico obtenida a partir de E. coli y que es capaz de catalizar una reacción para producir ácido N-acetilneuramínico.

Un ejemplo de un método conocido de descomposición es la descomposición del ácido colomínico, que es un polímero del ácido N-acetilneuramínico producido por Escherichia coli, etc [J. Biochem., 82, 1425 (1977)].

Los métodos conocidos que utilizan enzimas incluyen los siguientes: métodos que utilizan ácido N-acetilneuramínico aldolasa, ácido pirúvico y N-acetilmanosamina [J. Am. Chem. Soc., 110, 6481 (1988);

J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988)]; un método que utiliza ácido N-acetilneuramínico aldolasa, ácido pirúvico y N-acetilglucosamina en condiciones alcalinas (Patente EE.UU Nº 5.665.574); métodos que utilizan ácido N-acetilneuramínico aldolasa, N-acetilglucosamina 2- epimerasa, ácido pirúvico y Nacetilglucosamina [Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 30, 827 (1991); Carbohydrate Research, 306, 575 (1998)]; y métodos que utilizan ácido N-acetilneuramínico sintetasa, ácido fosfo-enol pirúvico y Nacetilmanosamina (patente japonesa JP 3944866; Glycobiology 7, 697 (1997)).

Los métodos anteriores para producir ácido N-acetilneuramínico requieren operaciones complicadas o materiales costosos tales como el ácido pirúvico o el ácido fosfo-enol pirúvico, y todavía no se ha establecido ningún método económico para producir ácido N-acetilneuramínico.

Hasta ahora, no ha habido ninguna referencia que describa o sugiera que el ácido Nacetilneuramínico se pueda producir utilizando un cultivo de un microorganismo o una sustancia de cultivo tratado.

En lo que se refiere ácido N-acetilneuramínico aldolasa, se conocen las derivadas de plantas y de animales, y se sabe que los microorganismos que pertenecen al género Escherichia tienen la actividad de esta enzima. También se sabe que el gen nanA que codifica esta enzima está presente en una cepa de Escherichia coli. [Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)].

Se sabe que la ácido N-acetilneuramínico sintetasa está presente en microorganismos que pertenecen al género Escherichia, Neisseria, y Streptococcus, etc y se conoce que una cepa de Escherichia coli contiene el gen que codifica esta enzima, neuB [J. Bacteriol., 177, 312 (1995)].

Se sabe que la N-acetilglucosamina 2-epimerasa está presente en cerdos y ratas. Las propiedades de la enzima derivada del cerdo han sido investigadas [Biochemistry, 17, 3363 (1970)] y se ha obtenido el gen que codifica la enzima [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)]. Hasta el momento no se conoce ningún microorganismo que tenga la actividad de esta enzima.

En relación con la producción de ácido pirúvico, se conoce un método para producir ácido pirúvico utilizando un mutante de Escherichia coli [Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (1994)].

En relación con la producción de ácido fosfo-enol pirúvico, se conoce un método para producir ácido fosfo-enol pirúvico utilizando microorganismo de Saccharomyces, etc. (Patente Japonesa nº 6197778).

Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso económico para producir ácido Nacetilneuramínico sin utilizar materiales costosos como el ácido pirúvico y el ácido fosfo-enol pirúvico. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir ácido N-acetilneuramínico sin utilizar N- acetilmanosamina de coste elevado.

Compendio de la invención

Los presentes inventores han realizado una investigación intensiva para alcanzar los objetos anteriormente mencionados y han encontrado que el ácido N-acetilneuramínico se puede producir eficazmente a partir de material de bajo coste utilizando un microorganismo que sea capaz de producir ácido pirúvico o ácido fosfo-enol pirúvico. La presente invención se ha llevado a cabo basándose en este descubrimiento.

La presente invención se refiere a lo siguiente (1)-(11).

(1)Un proceso para producir ácido N-acetilneuramínico que comprende:

permitir que (i) un cultivo de un microorganismo que tiene actividad ácido N-acetilneuramínico aldolasa

o actividad ácido N-acetilneuramínico sintetasa, o una sustancia del cultivo tratado, (ii) un cultivo de un microorganismo capaz de producir ácido pirúvico o una sustancia del cultivo tratado cuando un microorganismo que tiene actividad N-acetilneuramínico aldolasa se utiliza en (i), o un cultivo de un microorganismo capaz de producir ácido fosfo-enol pirúvico o una sustancia del cultivo tratado cuando un microorganismo que tiene actividad ácido N-acetilneuramínico sintetasa se utiliza en(i), (iii) Nacetilmanosamina, y (iv) una fuente de energía necesaria para la formación de ácido pirúvico o ácido fosfo-enol pirúvico que está presente en un medio acuoso para formar y acumular ácido Nacetilneuramínico en el medio acuoso; y

recuperar ácido N-acetilneuramínico del medio acuoso.

(2) El proceso según lo descrito anteriormente (1) donde dicha N-acetilmanosamina se produce permitiendo que un cultivo de un microorganismo con actividad N-acetilglucosamina 2-epimerasa o una sustancia del cultivo tratado y N-acetilglucosamina estén presentes en un medio acuoso para formar y acumular N-acetilmanosamina en el medio acuoso.

(3) El proceso según lo descrito anteriormente (2) donde dicho microorganismo con actividad Nacetilglucosamina 2-epimerasa lleva un ADN recombinante compuesto de un fragmento de ADN que comprende ADN que codifica N-acetilglucosamina 2- epimerasa y un vector.

(4) El proceso según lo descrito anteriormente (3) donde dicho ADN que codifica N-acetilglucosamina 2epimerasa es ADN derivado de un microorganismo que pertenece al género Synechocystis.

(5) El proceso según lo descrito anteriormente en (3) o (4) donde dicho ADN que codifica Nacetilglucosamina 2- epimerasa se selecciona del grupo que consiste en:

(a) ADN que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 1; y

(b) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 2

(6) El proceso según cualquiera de lo descrito anteriormente en (1) – (5) donde dicho microorganismo con actividad ácido N-acetilneuramínico aldolasa es un microorganismo que pertenece al género Escherichia

o Corynebacterium.

(7) El proceso según cualquiera de lo descrito anteriormente (1) – (6) donde dicho microorganismo con actividad ácido N-acetilneuramínico sintetasa es un microorganismo que pertenece al género seleccionado del grupo que consiste en Escherichia, Neisseria, y Streptococcus.

(8) El proceso según cualquiera de lo descrito anteriormente (1) - (7) donde dicho microorganismo capaz de producir ácido pirúvico es un microorganismo que pertenece al género seleccionado del grupo que consiste en Escherichia, Corynebacterium y Saccharomyces.

(9) El proceso según cualquiera de lo descrito anteriormente (1) – (8) donde dicho microorganismo capaz de producir ácido fosfo-enol pirúvico es un microorganismo que pertenece al género seleccionado del grupo que consiste en Escherichia, Corynebacterium y Saccharomyces.

(10) El proceso según cualquiera de lo descrito anteriormente (6) - (9) donde dicho microorganismo que pertenece al género Escherichia es Escherichia coli.

(11) El proceso según cualquiera...

1. Un procedimiento de producción de ácido N-acetilneuramínico que comprende:

(i) un cultivo de un microorganismo con actividad ácido N-acetilneuramínico sintetasa, o un producto de tratamiento del cultivo

(ii) un cultivo de un microorganismo capaz de producir ácido fosfo-enol pirúvico, o un producto de tratamiento del cultivo

(iii) N-acetilmanosamina

(iv) una fuente de energía necesaria para la formación de ácido fosfo-enol pirúvico

presentes en un medio acuoso para formar y acumular ácido N-acetilneuramínico en el medio acuoso; y

- recuperar el ácido N-acetilneuramínico del medio acuoso

donde dicho microorganismo capaz de producir ácido fosfo-enol pirúvico es un microorganismo que pertenece al género Escherichia o al género Corynebacterium,

y donde dicho producto de tratamiento del cultivo es un producto de tratamiento del cultivo seleccionado entre el grupo que consiste en el cultivo concentrado, el cultivo seco, las células obtenidas por centrifugación del cultivo.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha N-acetilmanosamina se produce poniendo un cultivo de un microorganismo que tiene actividad N-acetilglucosamina 2epimerasa o un producto de tratamiento del cultivo y N-acetilglucosamina en presencia de un medio acuoso para formar y acumular N-acetilmanosamina en el medio acuoso.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, donde dicho microorganismo que tiene actividad N-acetilglucosamina 2-epimerasa lleva un ADN recombinante compuesto por un fragmento de ADN que comprende el ADN que codifica N-acetilglucosamina 2-epimerasa y un vector.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, donde dicho ADN que codifica Nacetilglucosamina 2-epimerasa es ADN derivado de un microorganismo que pertenece al género Synechocystis.

5. El procedimiento según las reivindicaciones 3 y 4, donde dicho ADN que codifica Nacetilglucosamina 2-epimerasa se selecciona entre el grupo que consiste en:

(a) ADN que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1; y

(b) ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho microorganismo que tiene actividad ácido N-acetilneuramínico sintetasa es un microorganismo que pertenece a un genero seleccionado entre el grupo que consiste en Escherichia, Neisseria y Streptococcus.

7. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho microorganismo pertenece al género Escherichia es Escherichia coli.

8. El proceso según las reivindicaciones 1-7, donde dicho microorganismo que pertenece al género Corynebacterium es Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium actoacidophilum.