PRODUCCIÓN DE FGF18 EN HUÉSPEDES PROCARIOTAS.

La identificación y disponibilidad aumentada de genes de seres humanos y otros genomas ha conducido a un aumento de la necesidad de expresión y purificación eficaz de proteínas recombinantes. La expresión de proteínas en bacterias es de lejos el enfoque más ampliamente usado para la producción de genes clonados. Por muchas razones, la expresión en bacterias se prefiere a la expresión en células eucariotas. Por ejemplo, las bacterias son mucho más fáciles de cultivar que las células eucariotas. Más específicamente, la disponibilidad de una gran cantidad de herramientas genéticas moleculares sofisticadas y miles de mutantes hacen a E. coli, como un huésped de expresión, extremadamente útil para producción de proteínas. Sin embargo, la producción de alto nivel de proteínas funcionales en E. coli., especialmente las de fuentes eucariotas ha sido con frecuencia difícil. FGF18 es un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos que comparte homología de secuencia significativa con FGF8 y FGF17. Se cree que estos tres factores comprenden una subfamilia de las proteínas FGF. Como con todos los miembros de la familia de la FGF, FGF18 tiene efectos discretos en tejidos tanto en desarrollo como adultos y se cree que desempeña un papel en el desarrollo embrionario y la curación de heridas (véase, por ejemplo, Ornitz y Marie, Genes & Development, 16: 1446-1465 (que analiza el papel de todas las FGF, incluyendo FGF18 en el desarrollo de hueso)). En particular, se ha mostrado que FGF18 tiene efectos proliferativos en cartílago y tejidos neurales, entre otros (Ellsworth y col, Osteoarthritis and Cartilage (2002) 10, 308 320; Ellsworth y col. Stroke (2003) 34(6): 1507-12). Se ha producido FGF18 en células procariotas, en particular E. coli. La proteína producida en bacterias resultante no está glucosilada y se produce en un estado agregado. Los experimentos iniciales indicaron que FGF18 producida en bacterias dio como resultado truncación de la proteína, produciendo FGF18 truncada (trFGF18). Como la versión truncada parecía tener propiedades biológicas muy similares, si no idénticas, a la proteína de longitud completa, se realizaron después construcciones que producían solamente la versión truncada. La producción de FGF18 o trFGF18 de E. coli requiere que las proteínas agregadas se solubilicen a partir de los cuerpos de inclusión insolubles y se renaturalicen o replieguen. Sin la renaturalización, la actividad específica de la proteína recombinante se reducirá significativamente. A pesar de los avances en la expresión de proteínas recombinantes en huéspedes bacterianos, existe una necesidad de procedimientos mejorados para producir proteínas FGF18 y trFGF18 biológicamente activas y recombinantes purificadas en sistemas procariotas que dan como resultado mayores rendimientos para producción proteica. Estos y otros aspectos de la invención resultarán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada. Además, se identifican posteriormente diversas referencias. Ellsworth J L y col., Osteoarthritis and Cartilage. Abril 2002. Vol. 10 (4), páginas 308-320, indica que FGF-18 es un factor trófico para condrocitos maduros y sus progenitores. Hu M C y col, Molecular and Cellular Biology, Vol. 18(10), Octubre de 1998, páginas 6063-6074, indica que FGF-18 es un miembro de la familia FGF y estimula proliferación hepática e intestinal. Ellsworth J L y col, Stroke. Junio de 2003, Vol. 34(6), páginas 1507-1512, indica que FGF-18 redujo los volúmenes de infarto y los déficits de comportamiento después de oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratas. El documento WO 01/39788 describe procedimientos para dirigirse a células que expresan FGFR3 o FGFR2. En un aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión como se define en las reivindicaciones para producir proteínas FGF18 o trFGF18 que comprenden los elementos unidos de forma operativa de un origen de replicación procariota, un elemento de ADN de inicio de la transcripción y secuencia polinucleotídica y un terminador de la transcripción. En otro aspecto, el vector de expresión es el vector pSDH170 (SEC ID Nº:1) que puede usarse para producir FGF18. En otro aspecto, el vector de expresión es pSDH174 (SEC ID Nº: 2) que puede usarse para producir trFGF18. Realizaciones adicionales que proporcionan el vector de expresión pueden incluir un marcador seleccionable. En otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped procariotas como se define en las reivindicaciones transformadas con los vectores de expresión que se ha descrito que comprenden SEC ID Nº: 3:, una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 4. o un vector pSDH170 (SEC ID Nº: 1). En otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped procariotas como se define en las reivindicaciones transformadas con los vectores de expresión que se ha descrito que comprenden SEC ID Nº: 5, una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 6 o vector pSDH174 (SEC ID Nº: 2). En otra realización, la cepa huésped es la cepa de E. coli W3110 o la cepa zGOLD1 o zGOLD5. En otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos como se define en las reivindicaciones para producir proteínas FGF18 o trGF18 en condiciones en las que se expresa la proteína FGF18 o trFGF18. En una 2 E05853969 18-10-2011   realización, el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que expresa FGF18 después de transformarse con pSDH170. En una segunda realización, el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que expresa trfgh18 después de transformarse con pSDH174. En otra realización, el procedimiento comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende SEC ID Nº: 1. En realizaciones adicionales, el procedimiento comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende SEC ID Nº: 2. El procedimiento también comprende recuperar las células huésped del medio de crecimiento y después aislar la proteína FGF18 o trFGF18 de las células huésped. En otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para producir FGF18 o trFGF18 que comprende las etapas que se han descrito anteriormente, en un procedimiento de fermentación semicontinuo o un procedimiento de fermentación discontinuo como se ha definido en las reivindicaciones. En otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos como se definen en las reivindicaciones para producir una proteína FGF18 o trFGF18 que comprende cultivar una célula huésped como se ha descrito anteriormente en un matraz de agitación a una DO600 de 5 a 20 en un medio de crecimiento, inocular un frasco de fermentación con de 1 a 12 % de volumen a volumen (v/v) de medio de matraz de agitación que contiene células huésped, cultivar la célula huésped en un medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, suministrándose una solución de alimentación al frasco de fermentación antes de que transcurrieran 15 horas de tiempo de fermentación (EFT), añadir un agente inductor al frasco de fermentación a 20 a 30 horas de EFT y recoger las células huésped a 48 a 56 horas de EFT. En una realización, el agente inductor es isopropil ß-D tiogalactopiranósido (IPTG) a de 0,5 a 2 mM. En otra realización, la solución de alimentación comprende un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en glicerol y glucosa y la alimentación es de 5 a 15 gramos de carbohidrato por hora. En otra realización, el glicerol en la solución de suministro es de 40 a 70 % v/v de glicerol o la glucosa es de 40 a 70 % p/v de glucosa. En realizaciones adicionales, el glicerol es de aproximadamente 70 % v/v o la glucosa es de aproximadamente 60 % p/v. En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos como se define en las reivindicaciones para producir FGF18 o trFGP18 que comprenden sembrar en un matraz un inóculo que comprende células huésped E. coli W3110 que expresan un polipéptido de FGF18 o trFGF18 como se muestra en SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6 o una célula huésped E. coli W3110 que comprende vector pSDH170 o pSDH174, en los que se expresa un polipéptido FGF18 o trFGF18 y comprendiendo el medio crecimiento aproximadamente 5 g/l de glicerol, cultivar el inóculo en un medio de crecimiento durante 16 a 20 horas a aproximadamente 30 °C, transferir el inócul o en medio de crecimiento a un fermentador discontinuo a una concentración de inóculo de 0,5 a 5 % v/v, fermentar la fermentación discontinua a aproximadamente 37 °C y aproximadamente pH 6,8 con glicerol aproximadamente 2 %, introducir un suministro de glucosa a aproximadamente 8 horas EFT de aproximadamente 9,5 g de glucosa/ litro/hora y continuar hasta el final de un ciclo de fermentación, añadir IPTG a aproximadamente 24... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión para producir proteína FGF18 que comprende los siguientes elementos ligados de forma operativa: (a) un origen de replicación procariota; (b) un elemento de ADN de inicio de la transcripción; (c) una secuencia polinucleotídica como se muestra en SEC ID Nº 3; y (d) un terminador de la transcripción. 2. Un vector de expresión para producir proteína trFGF18 que comprende los siguientes elementos ligados de forma operativa: (a) un origen de replicación procariota; (b) un elemento de ADN de inicio de la transcripción; (c) una secuencia polinucleotídica como se muestra en SEC ID Nº 5; y (d) un terminador de la transcripción. 3. El vector de expresión de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende adicionalmente un marcador seleccionable 4. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho marcador seleccionable se selecciona del grupo que consiste en resistencia a tetraciclina, resistencia a ampicilina, resistencia a kanamicina, resistencia a neomicina, resistencia a cloranfenicol y el sistema hok/sok. 5. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la proteína FGF18 o proteína trFGF18 se produce bajo el control del promotor Tac, comprendiendo el vector al menos uno del gen Lacl-q, el gen ROP y gen de resistencia a kanamicina y en el que el origen de replicación procariota del vector es C01 E1. 6. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el vector pSDH170 (SEC ID Nº: 1). 7. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende el vector pSDH174 (SEC ID Nº: 2). 8. Una célula huésped procariota transformada con el vector de expresión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente. 9. La célula huésped procariota de la reivindicación 8 siendo la célula huésped una cepa deficiente en proteasa OmpT de E. coli. 10. La célula huésped de la reivindicación 8 ó 9, siendo la célula huésped una cepa de E. coli seleccionada del grupo que consiste en W3110, MM294, TG-1, JM-107, UT5600 y BL21. 11. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, siendo dicha célula huésped una cepa de zGOLD1 que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7. 12. Un procedimiento para producir una proteína FGF18 o proteína trFGF18, que comprende: (a) cultivar una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 en medio de crecimiento en condiciones en las que se expresa FGF18 o trFGF18; (b) recuperar las células huésped del medio de crecimiento; y (c) aislar la proteína FGF18 o proteína trFGF18 de las células huésped. 13. Un procedimiento para producir una proteína FGF18 o proteína trFGF18, que comprende: (a) cultivar una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 en un matraz de agitación a DO600 de 5 a 20 en un medio de crecimiento; (b) inocular un recipiente de fermentación con medio de matraz de agitación de 1 a 12 % v/v que contiene células huésped; (c) cultivar las células huésped en un medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, en el que se suministra una solución de suministro al recipiente de fermentación antes de las 15 horas del tiempo de fermentación transcurrido (EFT); (d) añadir un agente inductor al recipiente de fermentación a las 20 a 30 horas EFT; y (e) recoger las células huésped a las 48 a 56 horas EFT. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el agente inductor es isopropil ß-D tiogalactopiranósido (IPTG) de 0,5 a 2 mM. 15. El procedimiento de la reivindicación 13 o reivindicación 14, en el que la solución de suministro comprende un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en glicerol y glucosa a una concentración de medio de crecimiento 52 E05853969 18-10-2011   y una tasa de suministro de 5-15 gramos de carbohidrato por hora. 16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el glicerol es glicerol de 40 a 70 % v/v o la glucosa es glucosa de 40 a 70 % p/v. 17. Un procedimiento para preparar un sedimento celular o suspensión celular que comprende proteína FGF18 o proteína trFGF18 que comprende: (a) sembrar en un matraz un inóculo que comprende (i) una célula huésped E. coli W3110 que expresa un polipéptido de FGF18 como se muestra en SEC ID Nº: 4 o una célula huésped E. coli W3110 que comprende un vector pSDH170 de SEC ID Nº: 1, en la que se expresa un polipéptido de FGF18 y comprendiendo el medio de crecimiento glicerol aproximadamente 5 g/l; o (ii) una célula huésped E. coli W3110 que expresa un polipéptido de trFGF18 como se muestra en SEC ID Nº: 6 o una célula huésped E. coli W3110 que comprende un vector pSDH174 de SEC ID Nº: 2, en la que se expresa un polipéptido de trFGF18 y comprendiendo el medio de crecimiento glicerol aproximadamente 5 g/l; (b) cultivar el inóculo en medio de crecimiento durante 16-20 horas a aproximadamente 30 ºC; (c) transferir el inóculo cultivado en medio de crecimiento a un fermentador discontinuo a una concentración de inóculo de 0,5-5 % v/v; (d) fermentar la fermentación discontinua a aproximadamente 37 ºC y aproximadamente pH 6,8; con glicerol aproximadamente 2 %; (e) introducir un suministro de glucosa a aproximadamente 8 horas de tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de aproximadamente 9,5 g de glucosa/litro/hora y continuando hasta final de un ciclo de fermentación; (f) añadir IPTG a aproximadamente 24 horas EFT a concentración final de 0,5 a 2 mM; (g) fermentar aproximadamente 28 horas después de la adición de IPTG; (h) recoger el caldo de fermentación del fermentador; (i) añadir un volumen igual de agua al caldo de fermentación; y (j) homogeneizar y centrifugar el caldo de fermentación para recoger un sedimento celular o suspensión celular que comprende proteína FGF18 o material proteico de trFGF18. 18. Un procedimiento para aislar proteína FGF18 insoluble producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 que comprende las etapas de: (a) separar material proteico de FGF18 insoluble en agua de un sedimento celular o suspensión celular; (b) disolver el material proteico de FGF18 insoluble en un disolvente caotrópico; (c) diluir el disolvente caotrópico y replegar la proteína FGF18; y (d) aislar la proteína FGF18, en el que la proteína FGF18 aislada es capaz de ser biológicamente activa. 19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la proteína FGF18 aislada es al menos 90 % pura y tiene un nivel de endotoxina de menos de 10 unidades de endotoxina por mg de proteína FGF18. 20. Un procedimiento para aislar proteína trFGF18 insoluble producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 que comprende las etapas de: (a) separar material proteico de trFGF18 insoluble en agua de un sedimento celular o suspensión celular; (b) disolver el material proteico de trFGF18 insoluble en un disolvente caotrópico; (c) diluir el disolvente caotrópico y replegar la proteína trFGF18; y (d) aislar la proteína trFGF18, en el que la proteína trFGF18 aislada es capaz de ser biológicamente activa. 21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 y 20, en el que la proteína FGF18 o trFGF18 aislada es al menos 90 % pura. 22. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la proteína trFGF18 aislada es al menos 90 % pura y tiene un nivel de endotoxina de menos de 10 unidades de endotoxina por mg de proteína trFGF18. 23. Un procedimiento para aislar proteína FGF18 insoluble producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende las etapas de: (a) separar de un caldo de fermentación un sedimento celular o suspensión celular que comprende material proteico de FGF18 insoluble en agua; (b) homogeneizar el sedimento celular o suspensión celular para recoger cuerpos de inclusión; (c) disolver el material proteico de FGF18 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende una sal de guanidina; (d) diluir el disolvente caotrópico por adición de un tampón de replegamiento que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes; (e) aislar la proteína FGF18 retirando proteínas no plegadas y agregadas por filtración; y (f) purificar la proteína replegada FGF18 en una columna de intercambio catiónico; en el que la proteína FGF18 aislada y purificada es biológicamente activa y es al menos 90 % pura. 53 E05853969 18-10-2011   24. Un procedimiento para aislar proteína trFGF18 insoluble producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende las etapas de: (a) separar de un caldo de fermentación un sedimento celular o suspensión celular que comprende material proteico de trFGF18 insoluble en agua; (b) homogeneizar el sedimento celular o suspensión celular para recoger cuerpos de inclusión; (c) disolver el material proteico de trFGF18 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende una sal de guanidina; (d) diluir el disolvente caotrópico por adición de un tampón de replegamiento que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes; (e) aislar la proteína trFGF18 retirando proteínas no plegadas y agregadas por filtración; y (f) purificar la proteína replegada trFGF18 en una columna de intercambio catiónico; en el que la proteína trFGF18 aislada y purificada es biológicamente activa y es al menos 90 % pura. 25. Un procedimiento para aislar proteína FGF18 insoluble producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende las etapas de: (a) separar de un caldo de fermentación un sedimento celular o suspensión celular que comprende material proteico de FGF18 insoluble en agua; (b) homogeneizar el sedimento celular o suspensión celular para recoger cuerpos de inclusión; (c) disolver el material proteico de FGF18 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende una sal de guanidina; (d) diluir el disolvente caotrópico por adición de un tampón de replegamiento que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes; (e) aislar la proteína FGF18 retirando proteínas no plegadas y agregadas por filtración; (f) purificar la proteína replegada FGF18 en una columna de intercambio catiónico; y (g) purificar el eluato de FGF18 de la etapa (f) en una columna de interacción hidrófoba, en el que la proteína FGF18 aislada y purificada es biológicamente activa. 26. Un procedimiento para aislar proteína trFGF18 insoluble producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende las etapas de: (a) separar de un caldo de fermentación un sedimento celular o suspensión celular que comprende material proteico de trFGF18 insoluble en agua; (b) homogeneizar el sedimento celular o suspensión celular para recoger cuerpos de inclusión; (c) disolver el material proteico de trFGF18 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende una sal de guanidina; (d) diluir el disolvente caotrópico por adición de un tampón de replegamiento que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes; (e) aislar la proteína trFGF18 retirando proteínas no plegadas y agregadas por filtración; (f) purificar la proteína replegada trFGF18 en una columna de intercambio catiónico; y (g) purificar el eluato de trFGF18 de la etapa (f) en una columna de interacción hidrófoba, en el que la proteína trFGF18 aislada y purificada es biológicamente activa. 27. Un procedimiento para aislar proteína FGF18 producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende las etapas de: (a) separar de un caldo de fermentación un sedimento celular o suspensión celular que comprende material proteico de FGF18 insoluble en agua; (b) homogeneizar el sedimento celular o suspensión celular para recoger cuerpos de inclusión; (c) disolver la proteína FGF18 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende clorhidrato de guanidina aproximadamente 6 M, ditiotreitol 40 mM (DTT) durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente; (d) replegar la proteína FGF18 disuelta en una solución diluyendo en tampón de replegamiento que comprende Tris 50 mM, NaCl 120 mM y CuSO4 0,5 mM; (e) filtrar la solución; (f) cargar la solución en columna de resina equilibrada a pH 8,0 usando tampón de acetato sódico; (g) lavar la columna de resina con cloruro sódico aproximadamente 0,4 M; (h) lavar la columna de resina con cloruro sódico aproximadamente 0,75 M para eluir proteína FGF18 unida; (i) añadir sulfato de amonio a una concentración de aproximadamente 1,5 M para eluir y filtrar la solución de eluato; (j) cargar el eluato en una columna de resina de cromatografía de interacción hidrófoba equilibrada a sulfato de amino 1,5 M, cloruro sódico 0,05 M en tampón de acetato sódico; (k) lavar la columna con sulfato de amonio aproximadamente 1,5 M, cloruro sódico 0,05 M en tampón de acetato sódico; (l) diluir el eluato a una conductividad de aproximadamente 30 mS/cm con agua; (m) cargar el eluato en una columna de SP Sepharose® HP equilibrada con tampón de acetato sódico; (n) lavar la columna con gradiente lineal de 20 volúmenes de columna de cloruro sódico de 0,3 a 0,7 M; y 54 E05853969 18-10-2011   (o) concentrar y aislar la proteína FGF18 a través de intercambio de tampón usando ultrafiltración de flujo tangencial. 28. Un procedimiento para aislar proteína trFGF18 producida por una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende las etapas de: (a) separar de un caldo de fermentación un sedimento celular o suspensión celular que comprende material proteico de trFGF18 insoluble en agua; (b) homogeneizar el sedimento celular o suspensión celular para recoger cuerpos de inclusión; (c) disolver la proteína trFGF18 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende clorhidrato de guanidina aproximadamente 6 M, ditiotreitol 40 mM (DTT) durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente; (d) replegar la proteína trFGF18 disuelta en una solución diluyendo en tampón de replegamiento que comprende Tris 50 mM, NaCl 120 mM y CuSO4 0,5 mM; (e) filtrar la solución; (f) cargar la solución en columna de resina equilibrada a pH 8,0 usando tampón de acetato sódico; (g) lavar la columna de resina con cloruro sódico aproximadamente 0,4 M; (h) lavar la columna de resina con cloruro sódico aproximadamente 0,75 M para eluir proteína trFGF18 unida; (i) añadir sulfato de amonio a una concentración de aproximadamente 1,5 M para eluir y filtrar la solución de eluato; (j) cargar el eluato en una columna de resina de cromatografía de interacción hidrófoba equilibrada a sulfato de amino 1,5 M, cloruro sódico 0,05 M en tampón de acetato sódico; (k) lavar la columna con sulfato de amonio aproximadamente 1,5 M, cloruro sódico 0,05 M en tampón de acetato sódico; (l) diluir el eluato a una conductividad de aproximadamente 30 mS/cm con agua; (m) cargar el eluato en una columna de SP Sepharose® HP equilibrada con tampón de acetato sódico; (n) lavar la columna con gradiente lineal de 20 volúmenes de columna de cloruro sódico de 0,3 a 0,7 M; (o) concentrar y aislar la proteína trFGF18 a través de intercambio de tampón usando ultrafiltración de flujo tangencial; y (p) intercambiar el tampón a tampón de formulación usando ultrafiltración de flujo tangencial. 29. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23-28 en el que la sal de guanidina se selecciona del grupo que consiste en clorhidrato de guanidina y tiocianato de guanidina. 30. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18-26, en el que la actividad biológica se mide usando un ensayo de proliferación celular de FGF18. 31. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende SEC ID Nº: 3. 32. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende SEC ID Nº: 5. E05853969 18-10-2011   56 E05853969 18-10-2011   57 E05853969 18-10-2011